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鼠疫诊断潜在靶点的筛选

王鹏

   鼠疫(Plague)是一种由鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)引起的自然疫源性疾病,是一个古老但迄今仍严重威胁人类的传染病。历史上,席卷全球的三次鼠疫大流行曾夺走了数亿人的生命;近年来,全球每年仍有千例左右的鼠疫病例报告,鼠疫仍是人类面临的一个重要公共卫生问题。 鼠疫免疫学诊断是鼠疫监测及临床诊断的一种重要手段。鼠疫免疫学诊断主要是以鼠疫菌特异性抗原—F1荚膜抗原(F1)为基础。然而,由于自然界存在缺失F1的鼠疫菌株,这使单一针对F1的诊断方法存在漏诊的可能性;同时,F1又是一种温度调控表达的蛋白,在37℃大量表达,而低于28℃不表达或微量表达,这使现行检测方法应用于28℃以下生长鼠疫菌的免疫学检测受限。 近年来,在浙江、广州等地血清学调查中,相继在一些正常人中检测到F1抗体,如何解释这一现象,对基于F1的检测方法提出质疑。 本研究,一方面发展了以重组F1(rF1)为基础的免疫诊断方法;另一方面通过羟胺切割F1、克隆表达及化学合成F1片段等方法对F1的B细胞表位进行了分析,筛选出F1上的两个B细胞表位( QFTTKVIGKDSRDFD 和TGSQDFFVRSIGSK ),这两个B细胞表位可以作为判别交叉反应的诊断靶点。 除F1外,本研究对21种鼠疫相关蛋白进行了克隆表达,通过对这些重组蛋白的免疫学评价,筛选出Caf1M和Pla两个潜在诊断靶点,并发展了以重组Caf1M(rCaf1M)和重组Pla (rPla)为基础的鼠疫诊断方法,为确诊是否与鼠疫感染相关提供了手段。 利用上述鼠疫诊断方法,对浙江F1抗体阳性人血清进行了检测,结果显示,浙江F1抗体阳性人血清与F1上两个B细胞表位都发生反应,说明浙江F1抗体阳性人血清不是F1表位交叉反应引起;另外此血清与Caf1M和Pla两种鼠疫菌蛋白都发生反应,说明F1抗体阳性人血清与接触鼠疫菌相关。 疫苗接种和自然感染都可以引发人群F1抗体阳性,为明确是那一种感染形式,需找出区分鼠疫疫苗株与自然分离株的生物标记。本研究选用鼠疫疫苗株EV76与云南自然分离株进行了比较蛋白质组与比较基因组学的分析。 比较蛋白质组结果表明,两者之间未发现明显区别的蛋白标记,但得到两个有价值的发现。一是云南德宏地区鼠疫分离株较鼠疫疫苗株EV76及其它云南分离株高表达甘油激酶和硫酸盐转运蛋白;二是携带6Kb质粒(pYC)的云南鼠疫菌较鼠疫疫苗株EV76及其它云南鼠疫菌高表达GroEL伴侣蛋白。 比较基因组学结果表明,除已知的鼠疫疫苗株EV76缺失102Kb pgm毒力岛基因外,鼠疫疫苗株EV76还缺失涉及细菌内甜菜碱的合成的3个相关基因(GI:4121108-4121110)及其它3个基因(GI:4121112-4121114)这些缺失基因可以作为潜在区别疫苗株与鼠疫自然分离株的靶点。 总之,本研究筛选出F1上的两个B细胞表位及Caf1M和Pla两个潜在诊断靶点,采用这些靶点检测浙江F1抗体阳性人血清,提示其与接触鼠疫菌相关;同时通过比较基因组学分析发现,基因GI:4121108-4121110及GI:4121112-4121114是潜在区别鼠疫疫苗株与鼠疫自然分离株的靶点。……   
[关键词]:鼠疫;免疫学检测;靶点;蛋白质组;基因组
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国疾病预防控制中心2010年