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树莓荧光原位杂交体系的建立及优化

刘源

   树莓(Rubus L.),又名悬钩子,属于蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus)多年生小灌木类落叶果树。中国树莓植物种类繁多、分布广泛,大都以野生状态存在,遗传背景复杂,目前我国树莓植物资源的鉴定方法主要集中在形态学标记、孢粉学标记和细胞学标记,而采用分子生物学等手段的研究还相对较少。通过对荧光原位杂交(FISH)过程各个因素进行筛选和评价,建立了适于树莓的FISH体系,并用45S rDNA探针对栽秧泡进行FISH初步定位验证,实验结果如下: (1) 45S rDNA在栽秧泡染色体的位置主要在短染色体,长染色体的着丝粒区,短染色体的着丝粒区至短臂区三种现象,臂比值>4:1的染色体中出现45S rDNA的现象较少,只有2号染色体的着丝粒区出现一个很弱的信号,45S rDNA出现在着丝粒区至短臂区占50%左右。核型公式为2n=12sm+2t。 (2)适于树莓植物荧光原位杂交的根尖压片法是:当根尖长至1~2cm、扦插环境气温17~23℃取材,用0.002mol/L 8-羟基喹啉4℃处理24h,卡洛氏固定液工(乙醇:冰醋酸=3:1)4℃固定24h,再用1mol/L HCl 60℃恒温解离30~40sec,最后用45%醋酸压片,液氮揭片。 (3)用乌泡子的45S rDNA核苷酸序列(Gene Bank:FJ472913)设计PCR特异引物,对影响PCR扩增结果的引物浓度和Mg2+浓度等因素通过正交设计进行优化筛选,在16个组合中,1、2、3、4、12、13和14号的电泳条带清晰,7至10号的电泳条带较弱,5、6、11和16号未出现条带。经分析发现,电泳条带清晰的组合其引物浓度均为5ng,其余的因素对结果影响不大。因此,本研究选择效果较好的1号做为45S rDNA的PCR扩增体系。其PCR扩增体系为:5ng树莓DNA模板,0.5μM each Primer,2mM dNTP, 12.5mM Mg2+,0.75M Taq DNA酶,2μL PCR Buffer。 (4)通过对染色体标本的变性条件、杂交探针用量和杂交后洗脱强度等进行优化筛选所建立的树莓植物的FISH体系是:载玻片浸入2×SSC含100μg/mL RNAse 37℃恒温1h,用2×SSC洗涤2×5min,染色体用4%多聚甲醛(pH=7.5)处理10min,2×SSC洗涤,然后用70%,95%和无水乙醇梯度脱水,每次5min,气干,染色体在0.2XSSC含70%甲酰胺溶液中70℃恒温处理3min,立即用-20℃预冷的70%,95%和无水乙醇梯度脱水,气干。杂交液的组成:5ng/μL探针DNA,5×SSC,50%甲酰胺,10%DS,0.1%SDS和3ng/mL变性的鲑鱼精DNA。杂交液沸水浴变性5min,立即冰浴10min,以20μL/片杂交液封片。37℃杂交过夜,杂交后浸入2×SSC除去盖玻片,制片在0.1×SSC含20%去离子甲酰胺的溶液中42℃恒温处理30min,2×SSC洗涤3次,每次5min。然后用2×SSC含0.2% Tween-20洗涤3min,ddH2O洗涤,自然晾干。制片用5μg/mL Avidin-FITC溶液37℃温育1h,用1μg/mL DAPI复染30min,最后用Olympus-BX51镜检。……   
[关键词]:树莓;荧光原位杂交;体系建立;栽秧泡
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:四川农业大学2010年