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柽柳eIF5A基因的抗逆功能研究

徐晨曦

   干旱、盐碱胁迫是影响植物生长发育的主要因素,应用基因工程手段对植物进行遗传改良已成为提高植物抗逆性的有效途径。研究抗逆相关基因的抗逆功能是基因工程抗性育种的前提。eIF5A是目前发现的惟一含有特殊氨基酸(hypusine)残基的蛋白质,其具体的生物学功能尚不清楚。已有研究表明,eIF5A参与植物细胞的诸多生命活动,并参与植物的抗逆反应。为研究eIF5A基因的功能,本研究对来自柽柳的eIF5A基因(TaeIF5A)的表达和功能进行了初步研究。 利用实时定量RT-PCR技术,对不同胁迫条件下TaeIF5A基因在柽柳中的时序表达进行了分析。结果表明,TaeIF5A基因能够应答NaCl、PEG、NaHCO3、CdCl2以及ABA胁迫,不同胁迫条件下TaeIF5A基因的表达模式各不相同,并且具有一定的组织器官表达特异性。利用基因枪介导的瞬时转化技术,将TaeIF5A-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞内瞬时表达,在细胞核和细胞质都观察到绿色荧光,说明TaeIF5A表达定位于细胞核和细胞质中。 利用TAIL-PCR技术,克隆得到长度为1550bp的TaeIF5A启动子。序列分析表明,该启动子区包含多种与逆境响应相关的顺式作用元件,如MYB、MYC、GT1、WRKY等。将eIF5A启动子构建到pCAMBIA1301中,使其驱动GUS表达,将重组质粒导入农杆菌中,用农杆菌介导法瞬时转化烟草,GUS染色显示转基因瞬时表达的烟草外植体有蓝色斑点,表明该启动子具有启动表达的活性。利用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥,通过对种子的潮霉素抗性筛选获得转化拟南芥, GUS染色结果表明,eIF5A基因主要在根部表达,在叶片中也有少量表达。 将TaeIF5A构建到酵母表达载体pYES2中,重组质粒pYES2-TaeIF5A转化酿酒酵母INVScl,比较重组和非重组酵母在NaCl、KCl、MgCl2、ZnCl、CuSO4、CdCl2、H202、山梨醇、Na2CO3和NaHCO3胁迫下的生长状况,验证TaeIF5A对不同非生物胁迫的抵抗能力。结果表明TaeIF5A对包括盐、盐碱、干旱、过氧化物以及重金属在内的多种胁迫具有抵抗能力。 为了进一步验证逆境胁迫下TaeIF5A基因的功能,将TaeIF5A基因构建到35S启动子驱动的植物表达载体pROKⅡ,通过农杆菌介导法转化山新杨。PCR、Southern杂交和Northern杂交检测表明TaeIF5A基因整合到山新杨基因组中,并能够表达。选取10个转基因株系组培苗进行了0.6% NaCl胁迫试验,比较非转基因和转基因山新杨地上和地下部分的长度,结果表明TaeIF5A基因提高了山新杨的耐盐能力,其中转基因株系L2和L3耐盐表现较其它各株系好。对L2、L3和非转基因山新杨组培苗进行ZnCl2、CuSO4、山梨醇及NaHCO3胁迫试验,发现非转基因和转基因山新杨在含5mMNaHCO3的培养基中无法生长而死亡,对非转基因和转基因山新杨的根长和高度的比较表明,TaeIF5A基因不同程度的提高了山新杨对重金属和干旱的耐受能力。将非转基因和10个转基因株系移栽至大棚,待树高达到约60-70cm时对其进行0.8%NaCl,分析盐胁迫条件下非转基因和转基因山新杨的可溶性蛋白含量、POD活性、SOD活性以及相对电导率的变化。结果表明,盐胁迫下,多数转基因株系的可溶性蛋白含量、POD活性、SOD活性比非转基因山新杨高,而相对电导率低于非转基因山新杨。此外,通过对盐胁迫下非转基因和转基因各株系的相对高生长和地径增长的比较发现,多数转基因株系的相对生长量高于非转基因山新杨,说明TaeIF5A基因的表达提高了转基因山新杨的耐盐能力。 为探索TaeIF5A表达的分子机制,首先构建了柽柳cDNA文库,并转化到酵母中。并将TaeIF5A基因构建到Bait载体,利用酵母双杂交系统筛选柽柳cDNA文库中与TaeIF5A相互作用的蛋白。共获得了6个与TaeIF5A互作的蛋白,其中3个通过进一步验证证明其具有相互作用,一个是未知功能蛋白,一个是与细胞生长和延伸有关的木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶(XTHs)前体蛋白,另一个是与生长素调节有关的ARF GTP酶激活子。TaeIF5A与木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶前体蛋白和ARF GTP酶激活子蛋白发生互作,说明TaeIF5A可能在细胞的生长发育、细胞壁的结构变化以及植物对非生物逆境胁迫的响应过程中发挥作用,但其互作的具体过程及意义还有待于进一步研究。 选择TaeIF5A启动子中与逆境响应相关的顺式作用元件,GT-1、MYC/E-box和W-box,分别将它们的序列以3次串联重复的形式构建到报告载体pHIS2中,利用酵母单杂交系统筛选TaeIF5A基因的上游调控基因。其中,筛选到可能与GT-1顺式作用元件互作的6个基因。其中,有4个蛋白是与叶绿体相关的蛋白,其它的两个分别是参与DNA修复的泛素结合酶,另一个是在植物的生长发育中起重要作用的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。筛选获得了7个可能与MYC/E-box顺式作用元件互作的基因,其中有4个是与光合作用相关的蛋白;除一个未知功能蛋白外,另外两个分别是羟甲基谷酰辅酶A还原酶,它是异戊二烯代谢途径中的限速酶;参与识别并结合DNA激活转录过程的RNA聚合酶β’亚基。获得了5个可能与W-box顺式作用元件互作的蛋白,其中一个是与植物干早、高盐和低温等逆境抗性相关的转录因子AP2转录因子;一个是与生物体DNA复制过程密切相关的MCMs家族中重要的一员,微小染色体维系蛋白3;另一个是果糖二磷酸醛缩酶,它是植物光合作用和呼吸作用中的关键酶之一;还有对泛素化修饰的特异性和精确时空性起关键作用的泛素结合酶E2;此外,与MYC/E-box顺式作用元件一样,获得可能识别该元件的RNA聚合酶β’亚基。这些蛋白是否与相应的顺式作用元件互作来调控TaeIF5A的表达还有待进一步研究。……   
[关键词]:怪柳;TaeIF5A;非生物胁迫;启动子;酵母双杂交;酵母单杂交
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:东北林业大学2010年