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转AtDCL2、AtDCL4和AtRDR6基因水稻研究

和琼姬

   DCL2、DCL4、RDR6是RNA干扰(RNA interference, RNAi)机制关键基因,在RNAi的起始、维持和沉默扩散过程中起关键作用。RNAi是植物体天然的抗病毒防御体系,利用RNAi技术进行植物抗病毒研究是近年来植物病毒学领域研究热点之一。在目前利用RNAi开展抗病毒研究中,主要是通过导入病毒来源的双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)或发夹RNA (hairpin RNA, hpRNA)诱发针对同源病毒的高效RNAi效应,最终表现出植物体对病毒高度甚至免疫抗性。本研究中尝试通过过量表达RNAi机制中参与病毒抗性的关键基因、增强RNAi在起始阶段对病毒复制时形成的dsRNA的切割作用,从而赋予植物体对病毒更高的抗性。这拓宽了目前利用RNAi进行抗病毒研究的思路,有助于丰富植物抗病毒种质创制的策略。 在RNAi机制研究中,以拟南芥为材料开展的参与RNAi的生物大分子结构和功能研究最为深入,因此我们克隆拟南芥DCL2、DCL4和RDR6基因开展本研究工作。克隆、测序结果表明,AtDCL2编码区由4125个核苷酸构成,AtDCL4编码区由5660个核苷酸构成;AtRDR6编码区由3591核苷酸构成。随后将3个基因分别连入真核表达载体pCV1300,并将载体转入农杆菌。利用农杆菌介导的遗传转化将AtDCL2导入水稻幼胚及成熟胚诱导的愈伤组织中,最终获得以幼胚为材料的转基因株系有9株,经PCR、PCR-Southern blot鉴定证明其中有8株为阳性植株,以成熟胚诱导的愈伤作为受体的转DCL2再生植株有82株,其中PCR阳性植株70株。利用农杆菌介导的遗传转化将AtDCL4导入水稻幼胚及成熟胚诱导的愈伤组织中,最终获得以幼胚为材料的转基因株系有81株,经PCR、PCR-Southern blot鉴定证明其中有79株为阳性植株,以成熟胚诱导的愈伤作为受体的转DCL4再生植株有86株,其中PCR阳性植株76株;农杆菌介导的AtRDR6转化水稻成熟胚诱导的愈伤实验中,最终获得128株再生植株,其中PCR阳性植株113株。RT-PCR结果表明外源基因能够正常表达。 在克隆AtDCL2过程中,我们发现AtDCL23 非翻译区序列的长度不一,对所有序列进行元件扫描分析表明,它们含有不同的顺式元件。为深入分析不同AtDCL23 UTR是否影响了其上游编码区的表达,我们选取其中的X6, M11, M12和M6为研究对象,把它们融合到GFP的下游,利用real-time PCR分析融合不同3 UTR的GFP在烟草叶片中的瞬时表达情况。结果表明GFP-X6的GFP mRNA的积累量要比没有融合序列的GFP的对照高出1倍以上,GFP-M6的mRNA表达量为对照的70%,GFP-M11和GFP-M12都只有对照表达水平的30%。结果说明不同的3 UTR确实影响了其上游编码区的表达水平。综合分析3 UTR调控基因表达结果与各自的序列结构、转录因子搜寻发现:M11与X6相比,在3’端延长的53 nt序列中包含了一个SBF-1结合位点和一个ARE元件。我们分别或同时突变这两个元件,再分析对GFP瞬时表达的影响,结果表明M11中SBF-1结合位点和ARE元件都起到了下调与其融合的编码基因表达的作用。为了检测M6比M12多出的加尾信号序列与GFP-M6基因表达上调(与GFP-M12相比)是否有关,我们把M6的第二个poly(A);加尾信号突变后进行瞬时转染,结果表明,突变后M6(M6T)的表达量仅为M6的40%,这说明在M6中,poly(A);加尾信号序列上调了GFP的表达。……   
[关键词]:RNAi;AtDCL2;AtDCL4;AtRDR6;转基因水稻;3'UTR
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江师范大学2010年