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黄芩苷的二次开发研究及含马兜铃酸中药材安全性评价示范研究

乔洪翔

   研究一黄芩苷的二次开发研究 背景及目的:肝脏疾病是危害人类健康的一类重要疾病,是人类因疾病死亡的主要原因之一,仅列于心脑血管疾病和肿瘤之后。我国是一个肝病高发的国家,每年因肝硬化引发终末期肝病新增病例数超过500万,年死亡率达20%-50%。据估计,我国每年用于乙肝及相关疾病的治疗费用高达1000亿人民币,给国家和个人造成了沉重的经济负担。因此,积极开发成本低、疗效好的创新技术及药物来防治终末期肝脏疾病就显得十分重要。原位肝移植术是目前治疗终末期肝病唯一有效的手段,但由于其手术复杂、费用高、成功率较低、肝供体少、需终生服用免疫抑制剂等诸多缺点,大大限制了在临床上的普及应用。骨髓间充质干细胞(bone marrow Mesenchymal stem cells, MSCs)具有自我更新和多向分化的潜能以及低免疫原性的特点,移植MSCs的治疗成本也远远低于原位肝移植术,因此MSCs移植术是一种新的理想的治疗终末期肝脏疾病的技术和手段。但是单纯的MSCs移植并不是最佳的治疗肝脏疾病的方案。本研究的目的就是要从中药中开发一个在体内体外均可以干预MSCs肝向分化的单体化合物,并配合MSCs移植,从中找到一种最佳的治疗方案,为临床提供参考。 方法:1.首先通过文献调研以确定具有肝保护作用的中药小分子化合物作为二次开发的候选化合物;建立MSCs筛药模型,并与计算机辅助药物机理研究模型配合,筛选出具有促进MSCs分化为肝脏细胞能力的黄芩苷。 2.体外诱导分化实验:将细胞分为HGF组、FGF-4组和黄芩苷组;用western方法在分化后4、7、10、14、21天分别检测肝细胞特异性蛋白AFP、ALB及CK18的表达;用RT-PCR方法在分化后7、14、21天分别检测肝细胞特异性基因HNF-3β、CYP2B1、AFP、Albumin. CK18及TTR的表达,并通过检测HGF和c-met的基因表达来说明MSCs可能的分化机制;在分化后14、21、28天分别检测肝细胞功能,包括糖原的储存、尿素的分泌、LDL的摄取、CYP450的活性和可诱导性。 3.黄芩苷治疗肝纤维化的疗效及机制:用CC14造成大鼠肝纤维化模型,于造模后第5周用药物介入治疗,以水飞蓟素作为阳性对照药。分别用动物血清酶学、组织病理学、羟脯氨酸、GSH、炎症因子表达等多项指标来评价黄芩苷治疗肝纤维化的疗效;并通过western和PCR方法对HGF/TGFβ1及PPARy/TGFβ1信号通路相关基因和蛋白表达进行检测,来说明黄芩苷治疗肝纤维化的机制。 4.最佳治疗肝纤维化方案的探讨:用黄芩苷和MSCs的组合,设计出5种治疗方案:黄芩苷组,MSCs移植组,用黄芩苷诱导的MSCs移植组,MSCs移植加黄芩苷给药组,用黄芩苷诱导的MSCs移植加黄芩苷给药组。分别用动物血清酶学、组织病理学、羟脯氨酸、GSH、炎症因子表达等多项指标来比较5种方案的疗效,并以此获得最佳的治疗方案。 结果:1.利用计算机辅助模型及MSCs模型,初步证明了红景天苷具有直接诱导MSCs分化为肝细胞的能力;黄芩苷具有促进MSCs肝向分化的作用。 2.黄芩苷可以显著性提高肝特异性基因和蛋白的表达;增加细胞糖原的储存、尿素的分泌、LDL的摄取;提高CYP450 1A1和2B1亚型的活性和可诱导性。黄芩苷促分化作用与HGF/c-met通路密切相关。 3.黄芩苷可以降低血清AST、ALT、ALP的活性,增加受损肝脏分泌ALB、TP的能力;下调羟脯氨酸的含量,有效抑制纤维化程度;增加GSH的浓度,提高机体清除自由基的能力;显著下调TNFa和TGFβ1的浓度,降低机体的炎症反应。黄芩苷的抗肝纤维化作用是通过上调HGF和PPARy的表达,抑制TGFβ1信号通路实现的。 4.用黄芩苷和MSCs的组合,设计出的5种治疗方案中,黄芩苷低剂量单独给药对肝纤维化几乎无治疗作用;单纯的MSCs移植可以显著改善肝脏损伤程度,但抗纤维化作用并不明显;两者联合应用可以显著对抗CCl4造成的大鼠肝纤维化。用黄芩苷诱导的MSCs移植可以提高单纯MSCs移植的疗效;在联合黄芩苷给药后,其治疗肝纤维化的效果进一步增加。 结论:本研究成功的建立了MSCs联合计算机辅助的筛药模型,筛选出来的黄芩苷具有较好的促进MSCs分化为肝脏细胞的能力,并且在体内通过作用于HGF/TGFβ1和PPARy/TGFβ1信号通路,起到对抗肝纤维化的作用。本研究很好的对黄芩苷进行了二次开发,并且通过比较药效学的方法找到了最佳治疗肝纤维化的方案,为临床提供了参考。 研究二含马兜铃酸中药材及中成药的安全性评价示范研究 背景及目的:冠心苏合丸是冠心病急性发作期的救治良药,但是长期服用可以导致肾脏损害,其主要原因是冠心苏合丸组分中含有青木香。青木香是马兜铃属植物马兜铃的干燥根,具有行气止痛、解毒消肿、祛湿等功效,临床应用较为广泛。但是马兜铃属植物药因含有马兜铃酸(aristolochic acid, AA)而具有潜在的肾毒性和致癌性。因此国家食品药品监督管理局发布通知,取消了青木香的药用标准,凡国家药品标准处方中含有青木香的中成药品种均将处方中的青木香替换为土木香(仅限于菊科植物土木香Inula helenium L.的干燥根)。本实验评价了土木香及冠心苏合丸(含土木香)的安全性,为临床安全用药提供数据。此外,本实验还评价了青木香及冠心苏合丸(含青木香)的安全性,借此作为反面教材来说明中药安全性评价的重要性;并通过比较毒理学的方法,来比较评价土木香与青木香、冠心苏合丸(含土木香)与冠心苏合丸(含青木香)及冠心苏合丸(不含木香)的安全性,为推广中药的安全性评价做出示范。 方法:1.小鼠急性毒性试验:将动物分为青木香、土木香、冠心苏合丸(含青木香)、冠心苏合丸(含土木香)和冠心苏合丸(不含木香)及正常对照组,按组别进行给药,观察14天内动物的中毒现象,并确定各药物的最大给药量或半数致死量。 2.大鼠长期毒性试验:将动物分为青木香、土木香、冠心苏合丸(含青木香)、冠心苏合丸(含土木香)、冠心苏合丸(不含木香)及正常对照组,按组别进行给药,共持续180天,停药恢复30天。于药后90天、药后180天及停药后30天分3批取材,对动物的心电图指标、血常规指标、凝血系统指标、血清生化指标进行测定,并对动物全身各脏器进行组织病理学检查。 3. Beagle犬长期毒性试验:将动物分为青木香高、低剂量,土木香,冠心苏合丸(含青木香)高、低剂量,冠心苏合丸(含土木香),冠心苏合丸(不含木香)及正常对照组,按组别进行给药,共持续180天,停药恢复30天。于药前、给药后的每个月及停药后1个月,对动物的心电图指标、血常规指标、凝血系统指标、血清生化指标、尿常规指标进行测定;并于药后90天、药后180天及停药后30天分3批处死动物,对全身各脏器进行组织病理学检查。 结果:1.冠心苏合丸系列药材在小鼠急性毒性试验中未发现有急性死亡现象,且药物的最大给药量均超过临床剂量的几十倍甚至几百倍。 2.青木香和含青木香的冠心苏合丸对大鼠有明显的毒性。能影响动物的食欲、减轻其体重;产生明显的血液系统毒性;影响肝肾功能,使肾小管、肝脏细胞坏死;诱发胃和膀胱癌变;还能使脾脏细胞及雄性动物的生殖细胞坏死,而且这些毒性作用是随着药物累积量的增加而增强的,同时也是不可逆的。土木香、含土木香的冠心苏合丸以及不含木香的冠心苏合丸虽然在长期给药期间会引起动物生化、血液学、心电图等指标的变化,但绝大部分指标仍属于正常范围内,而部分异常指标也能在停药恢复期内恢复正常。 3.在犬长期毒性实验中,青木香高低剂量、冠心苏合丸(含青木香)高低剂量均能影响动物的食欲、大幅减轻体重;产生明显的血液系统毒性,使动物产生严重的营养不良和贫血;严重影响动物肝脏功能,使肝脏发生脂肪变性、炎细胞浸润、肝细胞萎缩及坏死等一系列病变;使成熟的胸腺退化,产生免疫系统毒性;抑制睾丸和附睾的成熟,产生生殖系统毒性;大部分动物脾淤血,产生淋巴系统毒性。土木香、冠心苏合丸(含土木香)和冠心苏合丸(不含木香)可以使动物产生轻微的贫血和肝脏功能的异常,但是停药后这些毒性反应都可以恢复。 结论:青木香和冠心苏合丸(含青木香)是具有明显毒性的药物,长期服用可以造成全身多靶点多器官的毒性,包括血液系统毒性、肝脏毒性、肾脏毒性、免疫系统毒性、生殖系统毒性、淋巴系统毒性,并可诱发胃癌、膀胱癌和皮下腺癌。上述这些毒性作用是随着药物累积量的增加而增强的,同时也是不可逆的。土木香、冠心苏合丸(含土木香)以及冠心苏合丸(不含木香)长期服用可以使动物产生轻微的贫血和肝脏功能的异常,但是停药后这些毒性反应都可以恢复。因此,这三种药物是相对安全的,土木香和冠心苏合丸(含土木香)可以代替青木香和冠心苏合丸(含青木香)在临床上继续使用。……