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分子佐剂C3d对肠炎沙门氏菌Ⅰ型菌毛主要亚单位FimA免疫原性影响的研究

张伟娟

   肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis,SE)不仅能引起畜禽发病,也是人类食物中毒的主要病原之一,其广泛流行不仅给社会造成了极大的经济损失,而且严重威胁着人们的生命健康,是人类公共卫生的一大隐患。研究发现,肠炎沙门氏菌能够粘附并侵入多种细胞,这种能力被认为是其产生致病性的主要原因,而菌毛作为细菌粘附并侵入宿主细胞的主要毒力因子,对其致病性有着至关重要的作用。肠炎沙门氏菌主要有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、SEF14和SEF18等主要菌毛,其中大多数的肠炎沙门氏菌都表达Ⅰ型菌毛,FimA是Ⅰ型菌毛主要结构亚单位,其编码基因为fimA。 C3d是补体C3分子不能再被蛋白酶水解的最小片段,当C3d与抗原分子相连时,可以直接与抗原提呈细胞上的CR2受体结合,降低B淋巴细胞的活化阈,从而提高抗原分子的免疫原性。因此,C3d被认为是新型的分子佐剂,日益引起人们的关注。相继有报道证实C3d分子的佐剂作用,但这些大都是基于真核载体表达蛋白和一些DNA疫苗的研究,关于C3d分子对原核载体表达蛋白免疫原性的影响,目前还没有相关报道。 为探索C3d分子对原核载体表达蛋白免疫原性的影响,本研究选取肠炎沙门氏菌Ⅰ型菌毛的主要亚单位编码基因fimA为目的基因,构建pCold-fimA及含不同拷贝mC3d的pCold-fimA-mC3dn重组表达质粒。主要构建方法为:用PCR方法从肠炎沙门氏菌标准株SD-2染色体中扩增fimA片段,PCR产物经纯化、连接T载体和序列测定,将验证正确的目的基因fimA插入表达载体pCold-TF,构建重组质粒pCold-fimA,同时将已构建好的重组质粒pUC-mC3d(单拷贝)、pUC-mC3d2(2拷贝)及pUC-mC3d3(3拷贝)进行限制性内切酶消化,酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后,通过琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收得到上述不同拷贝mC3d的基因片段mC3d、mC3d2及mC3d3,将其分别插入已构建好的重组质粒pCold-fimA上,获得fimA串联不同拷贝mC3d的重组质粒pCold-fimA-mC3d、pCold-fimA-mC3d2和pCold-fimA-mC3d3。基于上述重组质粒构建,通过IPTG 15℃诱导24 h获得高效表达的可溶性FimA蛋白和串联不同拷贝mC3d的FimA-mC3dn融合蛋白,利用Novagen公司的固定化Ni2+亲和层析试剂盒对重组蛋白进行纯化,经SDS-PAGE鉴定,分别在70 kDa、100kDa、130 kDa和160 kDa处出现与预期大小一致的特异性条带Western-blot结果显示,肠炎沙门氏菌Ⅰ型菌毛的多抗均能识别上述重组蛋白,表明其具有良好的免疫原性和反应原性。 为进一步探索C3d分子对FimA免疫原性的影响,将表达纯化的可溶性FimA和FimA-mC3dn融合蛋白免疫BABL/c小鼠。免疫程序为:首免,分别用可溶性FimA、FimA-mC3d、FimA-mC3 d2和FimA-mC3d3裸抗原进行免疫,每种蛋白分0.1μg、1μg和10μg 3个免疫剂量组;间隔35 d进行二免,均用弗氏不完全佐剂乳化的FimA免疫,免疫剂量为10μg。免疫过程中每周采血分离血清,通过间接ELISA检测抗体效价的变化。二免1周之后,用肠炎沙门氏菌标准株SD-2对实验小鼠进行攻毒,攻毒剂量为10 cfu,然后观察各组小鼠的死亡情况。 蛋白免疫实验结果表明,当免疫剂量分别为0.1μg和1μg时,FimA免疫组和FimA-mC3dn免疫组之间抗FimA抗体效价无显著差异。当免疫剂量为10μg时,与FimA免疫组相比,FimA-mC3d2和FimA-mC3d3免疫组抗体效价分别提高了2倍和4倍;但FimA-mC3d与FimA的差别不明显;当免疫剂量为10μg时,FimA-mC3d3的抗体效价比FimA-mC3d和FimA-mC3d2的抗体效价分别提高了4倍和2倍。攻毒保护实验的结果表明,在免疫剂量为10μg时,FimA免疫组的保护率为50%(2/4),而FimA-mC3d2和FimA-mC3d3免疫组的保护率分别为75%(3/4)和100%(4/4)。 综合以上结果,显示C3d对原核载体表达蛋白的免疫原性有一定的增强作用,进一步证实C3d分子的免疫佐剂作用,为C3d在原核系统免疫原性的深入研究及沙门氏菌的防制提供依据。……   
[关键词]:SE;FimA;FimA-mC3d_n融合蛋白;免疫原性;免疫保护作用
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:扬州大学2010年