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粘红酵母遗传表达系统的建立

邓溢芳

   粘红酵母(Rhodotorula glutinis)是生产胡萝卜素、油脂、辅酶Q10等很有潜力的工业菌种,有很高的生物量和甲羟戊酸通量,并可在很多便宜易得的培养基上生长。 利用同源重组将外源基因整合到酵母染色体上实现外源基因稳定表达的技术已在酿酒酵母、产朊假丝酵母和乳酸克鲁维酵母等多种微生物中广泛应用。rDNA在酵母基因组中有100-200个重复单元,以顺向串联方式排列,以rDNA为同源整合的靶顺序构建的载体,既克服了通常整合载体只有几个拷贝的局限,同时又保留整合载体稳定性好的特点,是一类用于表达外源基因理想的载体系统。且酵母转化技术日益成熟,相继发展的原生质体法、LiAC法、电转化法都是效率很高的转化酵母细胞的方法。 本论文以遗传和分子生物学信息匮乏的粘红酵母工业菌株As.2.102为研究对象,通过整合表达载体的构建、表达系统和转化系统的建立,为粘红酵母成为工业化生产一系列目的产物的菌株材料或相应的微生物反应器提供技术平台。 比较与不同酵母菌株的生理生化特性和发酵特征,以及研究粘红酵母在形态学、生长和抗生素敏感性的特征。 借鉴rDNA序列分析在分子鉴定上的应用思路,从粘红酵母基因组扩增到621bp的26SrDNA和555bp的5.8S-ITSrDNA序列片段,上传GeneBank,编号为bankit1350518和bankit1350528。 以来自pGAPZA的启动子gap为启动元件,博来霉素基因(shble)为抗性筛选标记,绿色荧光蛋白酶基因(GFP)为报告基因,以扩增的到的两段rDNA为同源整合位点,构建了粘红酵母整合性表达载体pGAPZ/rD/GFP。通过改良PEG介导的醋酸锂完整细胞转化法和优化粘红酵母菌原生质体制备、再生方法,建立适于As.2.102菌株的转化方法,获稳定的转化效率。表明GAP启动子成功的启动了博来霉素基因和绿色荧光蛋白基因在粘红酵母中的表达,也证明载体pGAPZ/rD/GFP能同源整合到染色体上。采用的抗性基因shble和报告基因GFP二级筛选重组细胞,快速,简便和直观。 在本文中还尝试利用RACE技术扩增和克隆相关的基因片段和以pMD18T为基础的启动子探针载体筛选有启动活性的基因组部分酶切片段,这两种策略来克隆粘红酵母自身的启动子,建立了相应的方法。 本研究仍在继续完善和优化R.glutinis表达系统,希望能进一步对构建的同源整合载体的表达量和拷贝数的提高,阐述各功能元件和整合的机理,寻找更高效的启动子和更优化的各个元件组成,构建出分泌型、更高效的表达载体。……   
[关键词]:粘红酵母菌;同源重组;rDNA;高拷贝整合载体;遗传表达体系
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:北京化工大学2010年