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6-姜酚诱导慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡的蛋白质组学研究

韩新爱

   慢性粒细胞白血病(CML)是一种骨髓多能干细胞异常增殖的恶性疾病,95%以上的CML患者具有特异性Ph染色体t(9; 22) (q34; q11), c-abl从第9号染色体易位到第22号染色体断裂集簇区,形成bcr/abl融合基因,表达BCR/ABL融合蛋白。传统治疗疗效有限,新型靶向药物酪氨酸激酶抑制剂GleevecTM(STI571)价格十分昂贵,且存在原发或继发耐药,故开发研制新的、高效、价廉、同时又能减少CML耐药性的药物非常重要。6-姜酚是生姜的主要活性成分,国外已有研究报道6-姜酚对多种肿瘤细胞包括白血病细胞株HL-60细胞有增殖抑制和诱导凋亡的作用,但其抗肿瘤机制未明,目前研究多侧重于个别基因或蛋白质的表达情况。 目的:观察6-姜酚对慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞增殖、细胞周期、凋亡及活性氧自由基产生等生物学特性的影响;利用蛋白组学及生物信息学技术比较分析6-姜酚作用K562细胞前后的蛋白质表达谱差异,探讨其抗白血病作用机制,为寻找6-姜酚作用K562细胞的靶标蛋白提供理论依据。 方法:1.1)用Hochest-33258染色荧光显微镜观察K562细胞形态学的变化;2)CCK-8法检测6-姜酚对K562细胞的增殖抑制作用;3)流式细胞仪检测6-姜酚对K562细胞周期及早期凋亡细胞比例的影响;4)流式细胞仪检测6-姜酚对K562细胞线粒体膜电位和活性氧自由基水平的影响。2.以6-姜酚半数抑制量处理细胞48小时,分别收集6-姜酚处理和未经处理的K562细胞,提取总蛋白,建立蛋白质双向电泳图谱,用ImageMaster 2D Platinum图象分析软件进行比较,以差异倍数在2倍以上的蛋白质点作为显著性差异表达蛋白质筛选标准。利用串联飞行时间质谱MALDI-TOF/TOF-MS对候选表达差异蛋白做肽质量指纹(PMF)和MS/MS质谱鉴定。应用生物信息学,通过数据库查找分析,对差异表达蛋白进行功能分类和初步分析。 结果:1.1)6-姜酚处理组K562细胞出现细胞核固缩、边聚和凋亡小体,而空白对照组、DMSO组未见明显改变。2)6-姜酚作用K562细胞24、48、72小时后,明显抑制K562细胞增殖,24、48、72小时的IC50值分别是22.86μg/ml、15.75μg/ml、11.18μg/ml,且呈时间、剂量依赖性;3)空白对照组G1期、S期、G2期细胞所占比例分别为43.2%±0.50%、49.5%±0.30%、7.3%±0.20%,6-姜酚15μg/ml、20μg/ml处理组G1期所占细胞比例分别为50.5%±0.36%、61.6%±0.38%;S期细胞所占分别为45.7%±0.30%、35.7%±0.35%;G2期细胞所占比例减少,分别为3.8%±0.06%、2.5%±0.10%。6-姜酚15μg/ml、20μg/ml处理组G1期细胞比例与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.01),6-姜酚5μg/ml、10μg/ml处理组与空白对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);4)空白对照组和DMSO对照组的早期凋亡率分别为4.5%±0.5%、5.8%±0.6%,6-姜酚10μg/ml组、15μg/ml组、20μg/ml组的早期凋亡率分别是12.3%±0.3%、14.5%±0.5%、19.5%±1%,明显高于空白对照组和DMSO组(P<0.01);5)以罗丹明123(Rho—123)为线粒体膜电位指示剂,空白对照组和DMSO对照组的平均荧光强度(MFI)分别为100±0.8、98.5±0.7,姜酚15μg/ml和姜酚20μg/ml的MFI分别为68.48±3.5、64.87±4.5,与对照组和DMSO组相比有统计学意义(P<0.01):6)6-姜酚15μg/ml作用于K562细胞不同时间(0.5h, 1h,2h,3h),细胞内ROS水平随时间逐渐升高(P<0.05),不同浓度的6-姜酚作用于K562细胞,随着浓度增加,细胞内ROS水平逐渐升高(P<0.05)。2.建立K562细胞系的双向凝胶电泳图谱,鉴定出42个差异表达蛋白,共35个非重复性差异,其中19个高表达,16个低表达。 结论:1.6-姜酚对K562细胞有显著的增殖抑制作用,阻滞细胞于G1期、使线粒体膜电位下降、诱导细胞凋亡及活性氧自由基产生。2.6-姜酚处理后K562细胞表达的差异蛋白质涉及氧化应激反应、细胞周期调节、细胞凋亡信号转导、蛋白质生物合成及糖代谢等重要蛋白及蛋白酶。6-姜酚对K562细胞的增殖抑制和诱导凋亡机制涉及多个信号转导通路的复杂过程。……   
[关键词]:6-姜酚;慢性粒细胞白血病;K562细胞;凋亡;蛋白质组学
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:暨南大学2010年