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基底表面纳米结构的细胞学效应与离子液体的细胞相容性研究

王雪峰

   设计新型生物材料是组织工程研究的核心内容。通过材料改性能有效地改变材料的物理形貌和化学组成,从而获得全新的生物支架材料。本文研究发现了生物材料表面通过激光改性形成的周期性纳米结构在细胞水平引发一系列纳米生物学效应,并尝试从细胞学的角度分析了这些实验结果,这为设计智能化支架材料提供了有价值的理论指导。基于同样的细胞实验条件,本文又针对一类新兴的、化学结构具有很强可调性的绿色材料——离子液体(ionic liquids,ILs)的细胞相容性进行了系统评价。通过寻找ILs细胞相容性与其化学结构的关系,从而为开发基于ILs的新型生物材料提供前期的理论指导。 聚苯乙烯是一种广泛用作体外细胞和组织培养的非降解性高分子生物材料,也是研究生物材料表面物理化学性质对细胞行为影响的理想的基底材料。但由于其表面具有疏水性,不利于贴壁细胞生长,因此在使用前通常要经过富氧等离子体处理来增加其亲水性。本文采用波长为266 nm的偏振激光扫描平整的聚苯乙烯薄膜和一种类聚苯乙烯离子液体聚合物(polymeric ionic liquid,PIL)薄膜——聚(溴化1-辛基-4-乙烯吡啶)((poly (1-octyl-4-vinylpyridinium bromide),PC8PyBr)。原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)、傅立叶变换红外光谱仪(Fourier transform infrared spectrophotometer,FT-IR)和接触角测量仪测量的结果表明经激光改性的聚苯乙烯表面不仅引入了含羰基的亲水性基团,并且还形成了周期为250 nm、深度为60 nm的纳米结构(laser-induced periodic surface structures,LIPSS),表面能从43.4 mN/m增加到63.1 mN/m(平行于LIPSS方向);经激光改性的PC8PyBr薄膜表面形成了周期为170 nm、深度为50 nm的LIPSS。小牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)吸附实验表明在经激光改性的聚苯乙烯表面BSA的吸附量比较大。以大鼠神经胶质瘤细胞和人子宫颈鳞状上皮癌细胞为细胞模型,系统地观察了经激光表面改性的聚苯乙烯对细胞各种行为的影响。细胞实验结果表明经激光表面改性的聚苯乙烯能显著地影响细胞的各种行为——细胞粘附数目增多;细胞增殖速度加快;细胞运动减慢、并沿LIPSS运动;细胞伸出丝状伪足进行铺展、并在铺展过程中逐步沿LIPSS取向;细胞体和细胞核都沿LIPSS取向;细胞分裂方向也平行于LIPSS。标记粘附斑激酶和γ-微管蛋白的细胞免疫学实验结果进一步表明:对于培养在经激光改性的聚苯乙烯表面的细胞来说,粘附斑的面积较大;在细胞分裂中后期,两个微管组织中心分别位于细胞的两极,且它们之间的连线平行于LIPSS方向。因此,在激光表面改性聚苯乙烯过程中引入的亲水性基团可能在促进细胞粘附和增殖中起主要作用,而LIPSS作为永久性的定向机械刺激诱导细胞伸出丝状伪足并沿LIPSS取向、运动和分裂。其中LIPSS诱导细胞定向运动和定向分裂不仅有助于揭示生物材料表面各向异性的纳米结构诱导细胞发生特异性响应的作用机理,而且还有助于实现组织工程中控制细胞定向分布,从而保证了构建的人工器官具有特定的生理功能。 ILs是一类人工合成的、由有机阳离子和无机或有机阴离子构成的、在室温或室温附近温度下呈液态的盐类。本文系统地合成了由四类阳离子、四类阴离子和五类不同烷基侧链的阳离子组合而成的共38种ILs以及两种类聚苯乙烯PILs。以人子宫颈鳞状上皮癌细胞为细胞模型,研究了各种ILs和两种类聚苯乙烯PILs的细胞相容性。以细胞毒性作为细胞相容性的检测指标,采用MTT法检测了ILs的半数效应浓度(median effective concentration,EC50)。并比较了ILs的细胞毒性与其结构的关系;采用浓度相加模型,比较了ILs对细胞的作用模式与其结构的关系;并首次观察了1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(1-ethyl-3-methylimidium tetraflubromide,[emim][BF4])诱导细胞凋亡过程中细胞的形态变化和生化变化。实验结果表明:随着烷基侧链(乙基、丁基和辛基)长度增长,ILs的细胞毒性增加;季磷类ILs的细胞毒性最强,其次是咪唑类和吡啶类ILs,胆碱衍生物类和三乙基铵类ILs的细胞毒性最小;阳离子烷基侧链为乙基和丁基的ILs对细胞的作用模式相似,而阳离子烷基侧链为苄基和辛基的ILs的作用模式相似;[emim][BF4]诱导细胞呈现出一系列凋亡特征,如细胞质内形成空泡、细胞表面生成芽状突起、细胞核呈明显的凋亡特征、线粒体膜去极化、细胞质内ROS含量和游离的钙离子浓度增加。由此可见,细胞毒性相对较小的季铵类ILs和阳离子侧链较短(如乙基、丙烯基、丁基)的ILs可作为开发生物材料的备选对象。同时,还发现水溶性(聚(溴化1-乙基-4-乙烯吡啶)(poly (1-ethyl-4-vinylpyridinium bromide),PC2PyBr))对细胞毒性作用较大,而激光修饰能改善PC8PyBr的细胞相容性。……   
[关键词]:聚苯乙烯;LIPSS;离子液体;大鼠神经胶质瘤细胞;人子宫颈鳞状上皮癌细胞
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:上海交通大学2008年