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家蚕(Bombyx mori)耐氟性研究和细胞色素P450基因cyp6u1及cyp6α8的分子克隆与表达分析

曾媛琴

   氟中毒是严重危害人体健康的主要地方病之一,该病危害严重,不仅能够造成氟斑牙、氟骨症等硬组织的广泛损伤,还可引起全身软组织不同程度的广泛损害。阐明氟中毒致病机制,是当今研究的热点问题之一。 细胞色素P450酶系也就是多功能氧化酶(MFO),是所有需氧生物体都存在的代谢酶系。细胞色素P450基因由35亿年前的一个共同祖先进化而成,是最古老和最庞大的超基因家族之一。它对代谢与转化内源物质和活化与降解外源化合物进行催化和调控。昆虫中的细胞色素P450酶系作用涉及生长、发育、取食等过程,其对异生物质的代谢特性导致了昆虫对杀虫剂的抗药性和对有毒物质的耐受性。 家蚕(Bombyx mori是鳞翅目昆虫的模式生物,鳞翅目是昆虫中的第二大目。本研究基于家蚕基因组精细图和EST、全基因组基因芯片数据,对家蚕细胞色素P450基因Bmcyp6ul和Bmcyp6a8基因进行了克隆和生物信息学研究。本论文的主要研究结果如下: 1.家蚕耐氟性研究分析 研究了家蚕添氟方法及桑叶氟浓度检测方法。桑叶用200ug/mLNaF浸渍15分钟,自然晾干。将桑叶研磨,加入1mol/L的HCl浸泡1小时(轻微震荡),pH5-6的TISAB缓冲液定容至50ml,氟离子选择电极检测氟浓度,能够精细地检测出桑叶的氟浓度值。 筛选了家蚕耐氟性品种T6和敏感性品种734,检测出耐氟阈值200ug/mL。用200 ug/mL的NaF浸渍桑叶15min,4龄起蚕开始饲喂家蚕,发现耐氟性品种T6虽然体重增长速率低于清水对照组,但是仍然能够一直稳步成长至上蔟:而同时同等条件喂养的734却体重增长异常缓慢,至4龄后期,渐渐死亡,最终不能进入眠期,全部死亡。 检测了NaF对家蚕食桑量的影响。相对于对照组,T6和734的添氟组食桑量都有所减少,但是734食桑量减少量异常,严重影响了正常生长;检测了NaF对家蚕蚕沙量的影响。统计显示,添氟组蚕沙量明显低于对照组。除了食桑量减少造成的蚕沙量减少,NaF造成家蚕排泄困难。 检测了氟中毒家蚕体内氟含量和各组织的氟含量。统计显示耐氟品种T6和敏感品种734的蚕沙氟含量一直上升;敏感品种734排氟量在到达36ug后就直线下降,一直在36ug徘徊;T6排氟量到达233ug后开始下降。分析显示氟排泄是家蚕耐氟性的一种重要途径。检测了氟中毒家蚕T6各组织的氟含量,包括头、血液、表皮,中肠、马氏管、丝腺、精巢(卵巢),发现头部组织和马氏管中氟离子含量最高。头部组织对氟化钠的不敏感性与氟代谢相配合是家蚕耐氟性另一重要途径。检测了氟中毒家蚕蛾期和蚕卵的氟含量,发现蛾的氟含量约等于5龄7天的氟含量。 检测了家蚕添氟组与对照组的乙酰胆碱酯酶含量和活性变化。结果显示,与对照组相比,添氟组头部酶原蛋白含量明显升高,乙酰胆碱酯酶活性呈规律性的明显降低。分析显示,家蚕乙酰胆碱酯酶是家蚕耐氟性的重要靶标之一。乙酰胆碱酯酶酶原蛋白量的增加弥补了活性的缺失,可能是耐氟品种头部组织对氟不敏感性的原因。 2.家蚕细胞色素P450第六家族基因的克隆及功能研究 采用生物信息学方法获得与果蝇cyp6ul基因同源的家蚕cyp6ul基因序列,实验结果表明,该基因ORF为1476 bp,编码491个氨基酸,推定的蛋白质分子质量为56.15 kD,等电点为9.23。(GenBank登录号:HM130560)。同源性分析表明:Bmcyp6ul基因与蜜蜂同源基因cyp6AS13的相似性为56%:与拟南芥cyp72A82的相似性为48%;与人的cyp3A7基因的相似性为50%。芯片数据分析表明,Bmcyp6ul基因在家蚕5龄第3天幼虫组织表达量很低,只在精巢组织稍有表达,推测该基因具有功能特异性。依据家蚕基因组数据,通过BLASTP比对,RT-PCR克隆了家蚕Bmcyp6a8基因。结果表明,该基因ORF为1572bp,编码523个氨基酸,推定的蛋白质分子质量为61.52kD,等电点为8.17,只有1个内含子。生物信息学分析显示,该基因位于第16号染色体,与野蚕cyp6AE8的相似性较高,同源性为93%,与棉铃虫的同源性为57%,与人的cyp3A43的同源性为33%。GenBank登录号为:GQ241737。从NCBI上下载人、果蝇、蜜蜂、斑马鱼、线虫的基因组与Bmcyp6a8进行比对,发现同源性基因全部是P450基因,构建进化树,Bmcyp6a8与蜜蜂第六家族基因聚集成簇。芯片表达图谱显示,Bmcyp6a8基因具有功能特异性。……   
[关键词]:家蚕;耐氟;氟含量;Bmcyp6a8 Bmcyp6u1
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:西南大学2010年