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家蚕赤蚁突变的分子定位及淡赤蚁(ch~p)的分子基础初探

黄永燕

   从野桑蚕驯化到家蚕,在人类数千年的养蚕历史中,通过自然选择和人工诱导的方式,家蚕积累了大量丰富的可稳定遗传的突变资源,已报道的有超过100种关于体色的突变。家蚕的体色突变涉及家蚕的各个生长时期,幼虫期、蛹期、成虫期,包括蚕茧也具有丰富的色彩。家蚕的体色都是由表皮细胞和真皮细胞中的色素积累和相互作用呈现的,其主要色素有黑色素、蝶啶、眼黄素等。控制家蚕体内色素的基因很多,这些基因的变异可以形成不同体色突变,不同的基因变异也可以形成类似的体色突变,基因之间相互作用也能呈现出新的体色。大量稳定遗传的体色突变,为研究色素的合成提供了十分重要的资源。赤蚁突变基因作为标记基因在遗传分析、连锁检索和基因定位研究中发挥了重要的作用。通过对赤蚁基因的研究,可以促进这些基因资源在蚕业生产的应用,并将丰富家蚕遗传学的理论宝库。 家蚕SSR分子连锁图的发表以及SSR分子标记技术的诸多优点为家蚕分子连锁图谱和经典遗传图谱的整合创造了成熟的条件。本研究利用家蚕SSR分子连锁图的分子标记对家蚕显性赤蚁(Ia)和隐性赤蚁(ch)进行了定位研究,并对淡赤蚁(chp)形成的分子基础进行了初步探究,实验研究内容和结果如下: (1)配制基因定位的回交群体 以F1雌回交隐形亲本的回交群体(BC1F)用于标记的筛选与连锁关系的确定;以F1雄回交隐形亲本的回交群体(BClM)用于对标记进行基因型分析,以计算标记基因间与SSR标记间的遗传重组率,确定它们之间的遗传距离。选用西南大学家蚕基因资源库的近等位基因系Dazao-Ia和近交系C108配制lα基因的连锁分析组合和定位分析组合;选用近等位基因系Dazao-ch和近交系C108配制ch基因的连锁分析组合和定位分析组合。 (2)显性赤蚁lα基因的分子定位 用属于家蚕第9连锁群的11对SSR引物在亲本Dazao-Ia和BmIS-C108之间进行多态性筛选,找到了10对在两个亲本间表现多态性的引物,再用这10对引物对2个亲本、F1代和连锁分析组合BClF群体的20个个体(10个正常个体和10个表现赤蚁的个体),共23个个体基因组DNA进行PCR扩增和PAGE电泳检测,筛选到5对与标记基因lα连锁的SSR标记:S0903、S0904、S0907、S0908和S0910。用这5对SSR标记对lα突变基因的定位分析组合BC1M群体的100个个体基因组DNA进行SSR-PCR分析,经过数据统计和分析,利用作图软件得到突变基因和与它们连锁的5个SSR标记的连锁图。连锁SSR标记与突变基因lα在连锁图上的顺序依次为:S0907、lα、S0904、S0903、S0908、S0910。连锁图的遗传距离是44.4cM,距离lα最近的SSR标记是S0904,图距为1.0cM。 (3)隐性赤蚁ch基因的分子定位 利用属于家蚕第13连锁群的共11对SSR引物在定位系统亲本Dazao-ch和近交系C108间筛选得到了7对有多态性的引物。用两个亲本、F1代和BC1F代共23个个体基因组进行了连锁验证,找到了5对与标记基因连锁的SSR标记:S1308、S1309、S1311、S1312和S2213。用这5对标记对ch的定位分析组合BC1M群体的166个个体基因组DNA进行SSR-PCR分析,经过数据统计和分析,将ch基因定位于标记S1309和S2213之间,距离ch最近的标记是S1309,图距为7.3 cM;ch距离标记S2213遗传距离为9.1 cM。 (4)淡赤蚁(chp)的分子基础初探 在已知赤蚁突变ch与yellow基因有关的情况下,根据NCBI上yellow基因的CDS序列跨ORF设计引物扩增等位基因淡赤蚁(ch~p) cDNA中yellow基因,得到两种剪接方式的表达。克隆并测序,chp type1属于插入型突变,在第3外显子前插入不规律的一段序列,由TAA引起翻译提前终止。chp type2属于缺失型突变,由第2外显子和第4外显子直接相连,缺失整个第3外显子共189 bp(终止密码子与野生型相同)。其中,type1为淡赤蚁所特有的剪接方式,通过对其编码氨基酸的序列、糖基化位点分析、功能域预测及高级结构等分析,初步推测其为导致淡赤蚁表型的分子基础。 实验结果表明,yellow基因从家蚕胚胎期的12h就开始表达。yellow基因在家蚕的头部中高量表达,此处为淡赤蚁与正常大造表型差异最明显的地方,说明yellow基因参与了家蚕表皮的黑化。除了参与色素的合成影响家蚕体色,关于yellow基因在家蚕中究竟还起着怎样的作用,还有待更一步的研究。关键词:家蚕赤蚁突变SSR分子标记定位yellow基因淡赤蚁……   
[关键词]:家蚕;赤蚁突变;SSR分子标记定位;yellow基因;淡赤蚁
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西南大学2010年