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家蚕EST-SSR分子标记的筛选与初步应用

李傲祥

   家蚕(Bombyx mori)是遗传学上具有重要地位的模式生物,也是国际鳞翅目基因组协会确定的鳞翅目昆虫的代表,应用SSR(Simple Sequence Repeat)标记技术研究家蚕遗传多样性,寻找具有重要经济价值的基因资源,特别是用SSR标记构建家蚕高密度的遗传连锁图谱,定位有重要经济价值的基因,对选育高产优质家蚕品种具有极为重要的意义。1999年Reddy等报道了从家蚕基因组中分离出28个微卫星位点,用其中的15个微卫星标记对13个家蚕品种进行了多态性分析,Nagaraju等通过比较RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphisma)、RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)、SSR、ISSR(Inter-simple Sequence Repeat)在家蚕中的运用,认为SSR最适合做家蚕连锁图谱,目前在家蚕中已构建了包含518个SSR标记,覆盖3431.9cM的连锁图。常规SSR分子标记开发需要构建基因组文库、制备探针和分子杂交等,过程烦琐而且开发成本较高,极大地制约了其发展和应用,近年来,随着EST(Expressed Sequence Tags)计划在不同物种间的扩展和研究内容的深入,在很多有重要经济价值的生物中都积累了大量的EST序列,利用EST序列开发SSR标记(即EST-SSR)成为新的研究热点。EST-SSR标记除了具有基因组SSR标记的优点外,还可对决定重要表型性状的等位基因进行直接鉴定,主要由于其位于基因的转录部分,与功能基因紧密连锁;EST-SSR际记还具有物种间通用性高的特点,可以应用在一系列相关物种中。目前已在葡萄、甘蔗、小麦、黑麦、大麦、大豆、水稻、松树以及高羊茅等植物和中国对虾、马氏珠母贝、蜜蜂、绵羊、鲶鱼等动物中建立了EST-SSR标记并进行了多方面的分析。 截止2007年12月26日,NCBI数据库中已收录大约245000条家蚕EST序列,但目前这些序列中的EST-SSR的情况还未明确,更无利用这些序列来建立SSR标记的报道。本研究对现有家蚕第12连锁群中的EST-SSR信息进行全面分析,以期了解家蚕EST部分资源的特性,为利用家蚕EST建立SSR标记和探索其在家蚕遗传育种中的应用奠定基础。实验结果如下: 1)从NCBI公共数据库获得与家蚕12连锁群相关的ESTs序列4465条,做聚类和拼接处理后,得到581条无冗余ESTs序列,在122条序列中共检测到154个EST-SSR,占所研究的EST序列的2.73%,平均每3.12 kb含有一个EST-SSR;三和四核苷酸重复是主导类型,其大部分为Perfect形式,分别占EST-SSR总数的36.36%和28.57%;EST-SSR标记的核苷酸重复平均长度约为16.2bp,最长为30 bp;通过同源性比较,有86条SSR-EST没有找到同源序列,10条不符合筛选标准,其余26条SSR-EST中共含有40个SSR,14个(35.0%)位于5 -UTR,11个(27.5%)位于3 -UTR,15个(37.5%)位于CDS区。 2)为建立稳定的家蚕EST-SSR标记技术体系,本实验采用L16(45)正交试验设计,优化筛选了影响家蚕EST-SSR的主要PCR因素,建立了最佳的反应体系,在15μL反应体系中,包含2.0mmol/LMg2+,60 ng模板DNA,0.30 mmol/L dNTPs,0.50μmol/L引物及1.0UTaq酶,并通过梯度PCR实验筛选得到相应引物的最佳退火温度。以该体系为基础,应用EST-SSR引物扩增8个家蚕的基因组DNA,扩增条带清晰稳定,聚类分析结果能较好地反映供试家蚕的地理来源关系。以0.5的相似性为分割点,8个家蚕可分成2大类群,类群Ⅰ主要由中国系统家蚕组成,类群Ⅱ由日本系统家蚕组成。该研究为EST-SSR标记技术在家蚕分子生物学研究方面的应用奠定了基础。 3)采用回交法把显性耐氟主效基因导入到性状优良的家蚕夏芳中可以提高其后代的耐氟性,利用前期获得的与家蚕耐氟基因紧密连锁的EST-SSR标记NS1201,在回交育种过程中对目标基因进行辅助选择,可以加快回交后代遗传背景的选择速度,因而可以大大缩短育种周期。……   
[关键词]:家蚕;耐氟性;EST-SSR;分子标记辅助育种;多态性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西南大学2010年