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非小细胞肺癌相关多肽IgY抗体的制备及其ELISA检测研究

杨剑

   肺癌是当前世界各国常见的恶性肿瘤之一,是目前全球发病率、死亡率都很高的肺部恶性肿瘤疾病。其中80%是非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)。肺癌早期诊断困难。80%的肺癌患者就诊时已属晚期,失去了手术根治的机会,放疗化疗效果不佳,5年生存率不到15%;而早期(IA期)肺癌手术后5年生存率达70%,但肺癌早期确诊率只有约15%,因此肺癌总的预后不良与肺癌缺乏有效的早期诊断手段有关。前期蛋白质组学研究利用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(Surface Enhanced Laser Desorption/IonizationTime-of-flight Mass Spectrometry,SELDI-TOF-MS)技术筛选了两个具有较高特异度和灵敏度的肺癌早期血清特异蛋白,本研究拟对前期成果进行二次开发。 多肽(peptide)是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,它由氨基酸组成,是蛋白质结构与功能的片段,具有很强的生物活性。利用人工合成多肽技术,采用化学合成法原理,并采用合成-检测-合成的方式,在自动多肽合成仪上合成两条多肽,两条多肽分别是从两个肺癌特异蛋白序列中分析筛选出的,质谱检测保证合成序列的正确性,最后进行HPLC纯化。将两条多肽偶联钥孔戚血蓝素KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin,KLH)作为抗原,以鸡作为实验对象,免疫制备IgY多克隆抗体抗体。IgY(egg yolk immunoglobulin)即从卵黄中提取的抗体,鸡为了保护后代,将血清中的抗体转移到卵黄中,卵黄抗体的沉降系数为7S,分子量16-18万,含糖约2.5%,与哺乳动物的IgG有所不同,被称为IgY。由2个亚基组成,重链67000-70000,轻链22000-30000。保守的哺乳动物蛋白对于系统进化远距离的鸟类可以产生更好的免疫原性。福氏完全佐剂与抗原等体积混合,充分乳化,水稀释-辛酸法结合硫酸铵沉淀法分离提取IgY,亲和层析进一步纯化特异性IgY,间接非竞争酶联免疫吸附法检测抗体效价,棋盘滴定法选择ELISA的最适工作条件。将抗64AA肽IgY抗体(Ab1)和抗36AA肽IgY抗体(Ab2)联合,用ELISA法检测肺癌血清样本96例,正常人样本102例。结果成功制备了非小细胞相关多肽IgY抗体,Ab1效价为.1:10~4,Ab2效价为1:10~5,用Ab1和Ab2组合做联合检测,以临界值0.241为阳性判断标准,96例肺癌患者血清中,阳性58例,敏感度为60.4%,102例正常人血清中,阳性19例,特异度81.4%。因此,运用IgY技术可以高效、大量制备多肽抗体,非小细胞肺癌相关多肽IgY抗体的ELISA检测试验表明IgY技术在肺癌诊断中有很好的应用前景。……   
[关键词]:IgY技术;人工合成多肽;多肽抗体;ELISA检测;肺癌诊断
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:东华大学2010年