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应用ELISA方法检测嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌

夏君

   本实验分别提取了嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌外膜蛋白(OMPs)作为抗原免疫健康新西兰白兔,制备了兔抗血清。根据ELISA原理,分别设计了常规的间接ELISA和Dot-ELISA法检测嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌。实验确定了两种ELISA方法的最佳优化条件、检测灵敏度、检测特异性、重复性和稳定性,并利用两种ELISA法和玻片凝集法检测了人工感染嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌的草鱼样品和野外采集的草鱼样品。研究结果如下: 1.利用间接ELISA法对所制备的嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌兔抗血清进行效价分析,其效价均为1:32000,可用于后面的ELISA实验工作。 实验所确定的间接ELISA最佳反应条件为:针对两种细菌的兔抗血清最佳稀释度均为1:5000,抗原的最佳浓度为分别为1×10~7 cfu/mL(嗜水气单胞菌)和1×10~6 cfu/mL(柱状黄杆菌);CBS(0.05 mol/L,pH 9.6)为理想的包被液;最佳酶标二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)稀释倍数为1:10000;抗原抗体最适反应时间、酶标二抗最适反应时间、底物最适反应时间分别为1h、1.5h和15min;最佳包被条件为37℃湿盒包被2h。在最佳优化条件下,利用间接ELISA检测嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌的最低检测限分别达到1.0×10~5 cfu/mL和5.0×10~4 cfu/mL,且该方法与水产常见致病菌副溶血弧菌、哈维氏弧菌、温和气单胞菌、迟缓爱德华氏菌无交叉反应,具有较好的敏感性和特异性,同时,阻断实验也表明两种抗血清分别对嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌具有良好的特异性,且重复性较好。 2.实验所确定的Dot-ELISA最佳反应条件为:最佳包被液为CBS(0.05 mol/L,pH 9.6);针对两种细菌的兔抗血清和酶标二抗的最佳稀释度均为1:500、1:1000;抗原抗体最适反应时间、酶标二抗最适反应时间、底物最适反应时间分别为60min、60min和15min;最佳包被条件为常温干燥1h或点样后37℃干燥1h。在最佳优化条件下,利用间接ELISA检测嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌的最低检测限分别达到1.0×10~4 cfu/mL和5.0×10~3 cfu/mL,表明该法的检测灵敏度较常规间接ELISA法要高,且该法具有较好的特异性、重复性和稳定性。 3.间接ELISA、Dot-ELISA和玻片凝集试验同时检测人工染病草鱼和野外采集的草鱼样品。确认肠道和鳃分别是检测感染嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌后较为理想的病原检测组织。间接ELISA、Dot-ELISA和玻片凝集试验(样品增菌后)对野外采集样品中嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌的检测阳性率均分别为20.0%、26.7%,几种方法的检测符合率为100%。 以上结果表明,本研究所建立的两种ELISA法能对嗜水气单胞菌和柱状黄杆菌进行准确、快速的检测,具有特异性好、灵敏度高的优点,尤其是Dot-ELISA法不需借助其他的实验仪器就能完成整个检测过程,更具实用价值。……   
[关键词]:间接ELISA;Dot-ELISA;嗜水气单胞菌;柱状黄杆菌;玻片凝集试验;快速检测
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2009年