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曲霉CJ22-326产壳聚糖酶基因的克隆、表达与定点突变

李松林

   壳聚糖酶可以专一性地水解壳聚糖,生成在很多领域都有着广泛应用的低聚壳聚糖。但是已报道的微生物产壳聚糖酶的酶活力普遍较低。本实验室从大海淤泥中成功筛选到了一株产壳聚糖酶菌株曲霉CJ22-326。此菌株可以在壳聚糖诱导培养基中产内切壳聚糖酶(CSN)和外切壳聚糖酶(CSX)。为了进一步提高壳聚糖酶的活力,本研究运用分子生物学的方法,对酶的基因进行了克隆和表达并对重组酶进行了定点突变研究。 本论文首先对CJ22-326进行了菌种的分子生物学鉴定。使用真菌通用引物NS1和NS8,以基因组DNA为模板,PCR扩增得到了曲霉的18s rDNA序列。对PCR产物进行鉴定和测序,结果发现CJ22-326与曲霉属的Aspergillus niger, Aspergillus proliferans,以及青霉属的Penicillium expansum和Penicillium chrysogenum KCTC6052等菌株的相似性均达到了96%。但是根据孢子形态特征,发现它不属于其中任何的菌种,我们认为它是曲霉属的新菌种。 利用3’-RACE (rapid amplification of cDNA ends)和5’-RACE的方法,使用简并引物,扩增得到了编码曲霉CJ22-326内切壳聚糖酶的cDNA,对其结构进行分析,根据分析结果设计了一对特异引物,成功扩增到了编码曲霉CJ22-326内切壳聚糖酶cDNA的结构基因(717 bp),此基因序列已在Genbank数据库申请登记,登记号为EU302818。为了获得曲霉CJ22-326外切壳聚糖酶的编码序列,利用RT-PCR的方法,扩增得到了编码外切壳聚糖水解酶的cDNA。根据cDNA序列分析结果,进一步扩增出了来源于曲霉CJ22-326的外切壳聚糖水解酶的编码序列(2652 bp)。该序列已在Genbank数据库申请登记,登记号为FJ449570。 将内切壳聚糖酶和外切壳聚糖酶的cDNA结构基因分别插入到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET28a-CSN和pET28a-CSX。将重组载体pET28a-CSN转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,重组菌在IPTG诱导下表达出有活性的重组内切酶,经SDS-PAGE检测和Western-blot鉴定,重组大肠杆菌有分子量约为29 kDa的蛋白表达带。采用不同的温度和IPTG诱导浓度,对重组内切酶的表达条件进行了优化。发现当温度为37℃,IPTG诱导浓度为1 mM时,蛋白质的表达量最高。重组质粒pET28a-CSX转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中之后,在IPTG诱导下表达出有活性的重组外切酶,SDS-PAGE和Western-blot检测到约100 kDa的蛋白表达带。使用Ni-NTA亲和层析对重组内切酶和重组外切酶进行了亲和纯化,分别得到了2.3 mg/L和1.2 mg/L蛋白质。使用DNS法对重组内切酶和重组外切酶的酶活力进行了测定,分别为1.18 U/mL和6.96 U/mL。 通过测定酶解液体系的粘度和对酶解产物的薄层层析分析,发现重组酶CSN以内切的方式水解壳聚糖的β-(1,4)糖苷键。而重组酶CSX是以外切的方式作用于壳聚糖的分子一端,依次切下氨基葡萄糖残基。对重组酶的酶学性质进行研究,结果表明:重组内切酶的最适pH值是6,最适反应温度是65℃,K_m和V_(max)分别为0.826 mg/ml和0.094mg/ml·min;重组外切酶的最适pH值是4.1,最适反应温度是50℃,K_m和V_(max)分别为0.146 mg/ml·min和7.758 mg/ml。重组内切酶和重组外切酶具有高度的底物专一性,除了对不同脱乙酰度的壳聚糖有作用以外,对几丁质和CMC没有水解活力。两者的反应速率均随着底物脱乙酰化度的提高而增加。 运用定点突变的方法,对保守的谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)进行定点突变后,发现Glu169和Asp160在突变后完全丧失了内切壳聚糖酶的活力。使用圆二色谱对野生酶与突变酶的二级结构进行研究,发现E169Q的结构和野生酶以及其它保持一定活力的突变酶(D160E)基本保持一致。……   
[关键词]:曲霉;内切壳聚糖酶;外切-β-D-氨基葡萄糖苷酶;克隆;表达;His-Tag纯化;定点突变
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:江南大学2009年