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氟苯尼考、安普霉素药物残留的ELISA检测方法研究

孙法良

   氟苯尼考和安普霉素分别属于氯霉素类和氨基糖苷类抗生素,目前在临床上应用十分普遍。并且两者在畜禽组织中的残留都会引起一系列后果。酶联免疫检测法(ELISA)是一种简便、快速,并非常适合大规模样品筛选的检测方法,但国内主要依靠价格昂贵的进口试剂盒。研制自主产权的快速检测ELISA试剂盒,已成为当务之急。因此,针对二者残留的快速检测方法的建立对控制动物性食品的质量等方面具有重要的社会和经济利益。 本论文旨在建立畜禽产品中氟苯尼考和安普霉素残留的间接竞争酶联免疫吸附(ci-ELISA)检测方法。研究内容和结果如下: 实验一氟苯尼考和安普霉素人工抗原的合成及鉴定 采用混合酸酐法,将氟苯尼考分别与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联;采用碳化二亚胺法将安普霉素与BSA偶联、戊二醛法将安普霉素与OVA偶联;制备出四种人工抗原FFC-HS-BSA、FFC-HS-OVA、Apra-BSA和Apra-OVA。制备的人工抗原经凝胶电泳(SDD-PAGE)、紫外扫描(UV)、红外扫描(IR)和动物实验进行了验证,均证明了人工抗原合成成功。 实验二氟苯尼考抗体的制备和安普霉素抗体的制备及鉴定 分别用FFC-HS-BSA和Apra-BSA作为免疫原免疫新西兰纯种白兔。制备的抗血清分别用间接ELISA和间接竞争ELISA检测效价和特异性,结果如下:氟苯尼考抗血清终点效价在1:51200以上,安普霉素抗血清终点效价在1:25600以上,并且特异性都很高。实验三鸡肉中氟苯尼考ELISA检测方法的建立及应用通过对氟苯尼考间接竞争ELISA的条件优化得到如下结论:抗血清稀释度为1:6400,封闭液为5%脱脂奶粉溶液,包被抗原FFC-HS-OVA的浓度为0.5μg/mL,辣根过氧化物酶标羊抗兔IgG(HRP-IgG)稀释度为1:20000。在这个实验条件,间接竞争ELISA检测氟苯尼考,得到回归方程Y= -0.1516X + 0.788,相关系数R~2 = 0.9859(其中y为B/B_0,x为Ig[FFC]),IC_(50) = 79.3 ng/ml,最低检测限(LOD)=0.18 ng/ml,线性范围在0.18~500 ng/ml。批内和批间平均变异系数分别为4.86%和7.77%。交叉反应试验中,抗血清与FFC结构相似的氯霉素和甲砜霉素交叉反应率分别为0.094%和0.098%,与其它药物交叉反应率均小于0.01%,表明该方法具有很强的特异性。鸡肉中添加回收率在84.14%~106.1%之间,回收率较高,能满足鸡肉中氟苯尼考的定性定量检测。 实验四鸡肉中安普霉素ELISA检测方法的建立及应用 通过间接竞争ELISA检测安普霉素,得到回归方程:y= 12.666x +28.22,相关系数R=0.9724(其中y为1-B/B0,x为Ig[Apra])。方法的最低检测限为0.1ng/mL,IC_(50) = 52.4 ng/ml,线性范围为0.1~100ng/mL。孔间差异为4.15%,板间差异为6.59%,实验重复性好。鸡肉中添加回收率在89.45%~108%之间。在交叉反应率试验中,与结构相似药物庆大霉素、链霉素、卡那霉素等的交叉反应率都小于0.01%。这表明所建立的方法有较高特异性和灵敏度,适合安普霉素的快速筛选。……   
[关键词]:氟苯尼考;安普霉素;人工抗原;抗体;残留;酶联免疫分析
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东农业大学2009年