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蓝狐细小病毒泰安株分子生物学特征研究及其TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

刘海防

   本研究从泰安地区某蓝狐养殖场送检的疑是感染细小病毒的蓝狐病料中分离到一株细小病毒。经常规病毒学方法及分子病毒学方法鉴定,所分离到的细小病毒为蓝狐细小病毒(Blue fox parvovirus,BFPV),命名为BFPV-TA。采用分子生物学技术对其VP1、VP2、NS1基因进行克隆和序列分析,并建立了BFPV荧光定量PCR检测方法。 1.采用体外细胞培养技术,应用F81细胞,从疑是细小病毒感染的蓝狐病料中分离到一株细小病毒,该病毒可以在F81细胞上产生BFPV样病变,经理化特性鉴定、血凝谱鉴定、人工感染蓝狐以及分子病毒学技术鉴定,证实所分离病毒为BFPV,将BFPV泰安分离株命名为BFPV-TA。 2.根据GenBank上发表的犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)与猫细小病毒(Feline parvovirus,FPV)核酸序列,设计扩增VP1、NS1基因的引物,采用PCR技术扩增其VP1、NS1全基因,将PCR产物克隆入pMD18-T载体,进行测序分析。结果,BFPV-TA VP1基因全长2256 bp,编码727个氨基酸,与CPV和FPV参照株的VP1基因同源性在98.7%-99.5%之间。BFPV-TA VP1蛋白375位氨基酸残基与CPV的VP1蛋白氨基酸残基一致,但其223位、236位、246位、466位、707位、711位氨基酸残基与FPV VP1蛋白的氨基酸残基一致,BFPV-TAVP1蛋白序列表现出了过渡型序列特征:VP2是构成BFPV衣壳蛋白的主要成分,VP2位于VP1的C端,VP1蛋白的C端氨基酸和VP2蛋白的N端氨基酸序列相互重叠,且二者终止于同一密码子,并且VP1的N端比VP2多154个氨基酸。VP2基因含有1个ORF,全长1755bp,共编码584个氨基酸,3个氨基酸残基发生突变,219I→V、300G→P、411E→A。BFPV-TA VP2基因与CPV和FPV参照株的同源性在98.5%-99.4%之间;BFPV-TA NS1基因含有1个ORF,全长2007bp,共编码668个氨基酸,8个氨基酸残基发生突变,43R→H,135H→Y,172K→R,179A→E,350D→N,409I→V,574I→V,616D→V。BFPV-TANS1基因与CPV和FPV参照株的同源性分别为98.6%-99.2%之间。VP1、VP2基因系统发生分析表明BFPV-TA与FPV的亲源关系较为密切:但NS1基因系统发生分析结果,BFPV-TA成单独的分支。通过对BFPV-TAVP1、VP2和NS1基因序列分析以及系统发生分析表明,BFPV-TA是介于FPV与CPV间的过度类型,说明狐狸可能在CPV的起源过程起到重要的作用。 3.根据BFPV VP2基因的保守基因序列设计合成了引物和探针,对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了BFPV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。用该方法对辽宁、山东等地的疑是蓝狐细小病毒的病料进行了检测。结果,该方法的阳性检出率最高,并且与VI、HA和常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。试验证明,该方法具有特异、敏感、快速的特点,为BFPV的临床检测和流行病学调查提供了新的技术手段。……   
[关键词]:蓝狐细小病毒;VP1基因;VP2基因;NS1基因;序列分析;实时定量PCR;TaqMan荧光探针
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东农业大学2009年