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共表达GPMV F基因和GPV VP3基因重组禽痘病毒生物学特性研究

李丹

   本实验对共表达鹅细小病毒VP3基因和鹅副粘病毒F重组禽痘病毒(rFPV-VP3-F)的理化特性、遗传稳定性、蛋白在细胞上及商品鸡体内的表达情况做了初步的研究。首先对该病毒进行纯化,并通过PCR、Dot-ELISA等方法鉴定病毒外源基因存在及表达情况。在理化特性研究实验中,将经理化因素处理的重组禽痘病毒(rFPV-VP3-F),接种到鸡胚成纤维细胞(CEF)上,观察处理前后重组禽痘病毒对鸡胚成纤维细胞的感染滴度的变化,得出该病毒的部分理化学特性。通过按不同的细胞数目,不同的接毒量对病毒繁殖的影响,摸索出病毒繁殖的最佳细胞数及最佳感染复数是当细胞密度为10~5/cm~2,感染复数为0.01时,病毒滴度可达3.08×10~5TCID50/100ul。在重组禽痘病毒在遗传稳定性研究的实验中,主要是将重组禽痘病毒在鸡胚成纤维细胞上连续传代20代,抽查第5代、第10代、15代和20代的遗传稳定性。从蚀斑的纯度看,这几代所出的蚀斑均为蓝斑,未发生外源基因丢失而产生白色蚀斑的情况。以第5代、10代、15代及20代重组禽痘病毒DNA为模板进行PCR扩增,分别扩增出了460bp的F基因部分片断,657bp的VP3基因部分片断。以另外两对引物扩增出F全长基因和VP3全长基因,测序后与原代相比较,F基因有两个核苷酸了生的改变,氨基酸未发生变化。VP3有三个核苷酸发生了变化,氨基酸也未发生改变。通过间接免疫荧光试验检测第5代、第10代、第15代和第20代重组禽痘病毒F、VP3基因表达情况。从实验结果看,以上几代重组禽痘病毒中的两个外源基因均可在CEF中稳定表达。综上所述,说明该重组禽痘具有较好的遗传稳定性,外源基因在传代过程中不会丢失,并可正确的表达相应的蛋白。将rFPV-VP3-F按10~6PFU/羽的量皮下接种于35日龄未经免疫的商品鸡,于免疫后的第7d、14d、21d、28d和35d采血分离血清,通过中和抗体检测抗GPMV-F基因的抗体水平,通过间接ELISA方法检测抗GPV-VP3基因的抗体水平。结果显示,重组禽痘病毒RFPV-VP3-F可在鸡体内产生与插入外源因基相应的蛋白,并可刺激机体产生相应抗体。……   
[关键词]:重组禽痘病毒;F基因;VP3基因;遗传稳定性;抗体
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:东北农业大学2009年