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局部注射唑来膦酸及同种异体成骨细胞移植修复股骨头坏死的实验研究

彭晨

   背景与目的: 股骨头缺血性坏死(Osteonecrosis of the Femoral Head,ONFH)是一种慢性进行性致残性疾病,如果不治疗,超过70%的病人在诊断后3-4年将不得不行假体置换术,由于其发病人群以30-50岁中青年为主,许多患者一生中不得不面对多次的关节置换,无论是精神上,还是经济上都是沉重的负担。早期治疗对防止患者致残和预后至关重要,保存自体股骨头,防止塌陷是治疗的主要目标。股骨头坏死塌陷的进展与修复反应密切相关,特别是坏死区骨吸收作用。坏死骨仍保留负重能力,但修复过程启动、再血管化和重建开始后却出现骨结构损害和力学性能降低。从本质上看,不是骨细胞的死亡引起承重区塌陷,而是随着再血管化的开始,破骨细胞对坏死骨的吸收造成结构的破坏。再血管化过程中,破骨细胞活动过度,成骨细胞能力不足,骨吸收与骨生成之间不平衡,机械性能降低,在坏死骨与活骨之间产生应力集中,最终发生塌陷。如果能延缓或者抑制坏死骨吸收直到有足够新骨形成,可以保持股骨头骨结构,缓解甚至阻止塌陷的发生。 双膦酸盐是作用很强的破骨细胞活性抑制剂,近几年应用双磷酸盐治疗股骨头坏死的研究逐渐开展并引起关注,其应用的生物学基础是以破骨细胞性骨吸收作用为特征的修复反应与股骨头变形发展之间的关系。研究发现在组织学水平,双膦酸盐可降低骨重建率,收缩骨重建范围,所保留的骨组织矿化增多,骨密度增高,保持骨结构,更好的对抗负重。 但是,应用双膦酸盐类药物治疗股骨头坏死仍有很多问题尚未解决:双膦酸盐对破骨细胞的影响及作用已得到大家的共识,但其对成骨细胞的作用还存在争议,不同种类、浓度的双膦酸盐影响不同;目前的给药剂量大多参考骨质疏松的治疗剂量,尚不知治疗股骨头坏死的最适剂量;双磷酸盐的给药途径为口服或系统性用药(静脉内或皮下注射),口服用药吸收性差,存在消化道并发症,系统性给药可能造成肾脏损害。另外,系统性用药的生物药效率研究表明,只有当坏死局部的血液循环恢复药物才会输送到达,为了取得较好的药效,动物实验中不得不给予较高的剂量,易导致成人骨软化和儿童长骨生长抑制。 股骨头坏死是股骨头局部缺血导致的局部坏死,有必要去研究股骨头骨内局部应用双膦酸盐阻止股骨头变形塌陷的治疗潜力,局部用药剂量小,不必考虑血运情况,可避免前述并发症。本研究应用第三代双磷酸盐—唑来膦酸,从唑来膦酸对体外培养的大鼠成骨细胞增殖、碱性磷酸酶活性、矿化和骨钙素(OCN)、骨保护素(OPG)/骨保护素配体(OPGL)mRNA表达的影响入手,探讨唑来膦酸对骨形成的影响和局部应用的可行性;制备大鼠股骨头创伤性坏死的模型并观察其病理形态变化,验证造模成功,探讨股骨头坏死的病理演进过程及机制;在髓芯减压术基础上,不同剂量唑来膦酸坏死区局部直接用药治疗,复合成骨细胞的同种异体移植,提高坏死局部成骨能力,以期望获得阻止骨破坏和增加新骨生成,缓解甚至阻止股骨头塌陷的目的。 方法: 1、唑来膦酸对体外培养的大鼠成骨细胞功能的影响: 新生24小时内SD大鼠,酶消化法无菌条件下分离大鼠颅盖骨成骨细胞,沉淀的细胞中加入含10%胎牛血清的DMEM培养液,吹打成细胞悬液植于培养瓶中,在5%CO_2、37℃饱和湿度条件下培养箱中培养。细胞24小时后贴壁,48小时换液一次,之后培养液每3天更换1次。细胞长满至80%后传代,应用第三代成骨细胞实验。细胞增殖检测(四甲基偶氮唑盐比色法,MTT法):按照培养基中唑来膦酸终浓度分为实验组:唑来膦酸浓度10~(-4)M—10~(-11)M,对照组:不加药,只加等量培养基。细胞经胰酶消化后PBS清洗,收集细胞,调整细胞悬液密度为7×10~3个/孔种于96孔板,每孔加培养基200ul,每组8个复孔,共5板,24小时贴壁后换含药培养基,对照组更换普通培养基,每3天更换一次培养基。分别于培养1、2、3、5、7天取1板行MTT检测,每孔加入20μlMTT(5mg/ml),37℃继续孵育4小时后终止培养,吸弃孔内培养液,每孔加入150μlDMSO(二甲基亚砜),振荡10分钟,在酶标仪上测定各孔光吸收值,波长490nm,取其均值,以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制出生长曲线,反映出不同组的细胞增殖状况。碱性磷酸酶(ALP)活性检测:按照含唑来膦酸浓度分为实验组:10~(-7)M,10~(-9)M,10~(-11)M及对照组4组,每3天更换含药培养基,对照组换普通培养基,培养5天后,胰酶消化瓶中细胞,PBS清洗后离心,1%SDS细胞裂解液裂解细胞后取其上清液50μl,每组6个复孔,加入96孔板中,采用硝基苯基质动力学法于酶标仪测量并经换算,测定各组细胞ALP活性。矿化功能测定:按照含唑来膦酸浓度分成10~(-7)M,10~(-9) M,10~(-11)M及对照组4组,实验组与对照组的培养液中加入浓度为10mmol/Lβ-甘油磷酸钠,每3天更换一次培养液,每天加入新鲜维生素C50mg/L,第21天终止培养,行矿化结节Von Kossa染色,矿化结节染为黑色,IPP6.0图像分析软件做矿化面积比较。实时荧光定量PCR(Real time PCR)检测OCN、OPG、OPGL mRNA表达水平:按照含唑来膦酸浓度分为实验组:10~(-7)M,10~(-9) M,10~(-11)M及对照组4组,实验组加含药培养基,对照组加普通培养基,3、7天后Trizol提取RNA,RNA质量鉴定后行逆转录和SYBR法荧光定量PCR扩增反应,β-actin为管家基因,检测OCN、OPG、OPGL mRNA表达水平,采用相对定量△△CT法,计算机软件分析结果。 2、大鼠股骨头坏死模型的制备: 6月龄SD大鼠32只,雌雄不限,体重400-450g。分组:实验组:按造模术后1、2、4、6周4个时间点将SD大鼠随机分成4组,每组8只。对照组:采用自身非实验侧股骨头做正常对照。采用Norman等方法制备大鼠创伤性股骨头坏死动物模型;腹腔注射10%水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉,俯卧位,左侧髋部脱毛,消毒,铺无菌巾。经大转子纵向切开皮肤皮下组织,沿臀大肌肌束方向劈开臀大肌,由骨附着处分离前2/3臀中肌,沿着转子的边缘横断髋关节囊前外侧,切断圆韧带,将股骨头脱位,用11号尖刀剥离股骨颈基底骨膜和纤维反折处,复位股骨头,生理盐水冲洗切口,逐层缝合髋关节囊和臀部肌肉,皮肤。大鼠置于空间充足的鼠笼,鼠粮置于鼠笼上方,进食时需下肢负重。分别于造模术后1,2,4,6周处死动物。行动物一般状态观察,大体观察股骨头软骨表面、光泽;拍X线片观察骨质密度,是否变形;HE染色,光镜下观察股骨头坏死不同时期病理形态学改变;采用CMIAS真彩色医学图象分析系统检测骨髓腔内脂肪组织与造血组织比值,并检测脂肪细胞直径、周长、面积等参数和计数空骨陷窝百分率;免疫组织化学染色技术检测OPG/OPGL蛋白在股骨头坏死组织中的表达。 3、局部注射唑来膦酸及同种异体成骨细胞移植修复股骨头坏死的实验研究: 6月龄SD大鼠,雌雄不限,体重400-450g。采用Norman等方法,行股骨头圆韧带离断,股骨头脱位,股骨颈骨膜剥离制备大鼠创伤性股骨头坏死动物模型。实验分组:造模组(A)、髓芯减压组(B)、皮下注射唑来膦酸组(C)和局部注射唑来膦酸组(D-G)(2.5%、5%、7.5%、10%皮下注射累积用药量),成骨细胞移植组(H)及局部注射7.5%唑来膦酸复合成骨细胞移植组(I)。C组分别于造模后1、4周皮下注射唑来膦酸0.1mg/kg。B、D-G于造模后一周,行手术治疗。于造模侧原切口切开皮肤至股骨大粗隆,在C形臂透视下,B组行髓芯减压术,钻孔后逐层闭合切口;D-G组钻孔后局部注射唑来膦酸治疗,剂量按体重计算,分别为C组给药方法累积用药量的2.5%、5%、7.5%、10%,骨蜡封闭钻孔,逐层闭合切口。酶消化法分离培养新生大鼠成骨细胞,经深低温冻存、复苏、传代后,H组以PBS重悬细胞,密度为10~7个/0.5ml,注射至股骨头钻孔隧道,骨蜡封闭钻孔;I组以含7.5%唑来膦酸PBS重悬细胞,密度为10~7个/0.5ml注射至股骨头减压隧道,骨蜡封闭钻孔,逐层闭合切口。设造模后六周为治疗终点,行动物一般状态观察,大体观察股骨头软骨表面、光泽;拍X线片观察骨质密度,骺商测量股骨头是否变形;HE染色,光镜下观察股骨头坏死病理形态学改变,破骨细胞计数;免疫组织化学染色观察OPG/OPGL蛋白表达情况;制作不脱钙骨切片经von kossa和Gimesa特殊病理染色行骨组织形态计量学测定,利用Leica Q Win V2.3图象分析软件,对骨组织切片进行形态观察和分析计量,根据公式计算得出静态参数骨小梁相对体积、骨小梁厚度、骨辛菏考肮切×悍掷攵?观察骨量变化和骨小梁形态。 结果: 1、唑来膦酸对体外培养的大鼠成骨细胞功能的影响: 细胞增殖测定:唑来膦酸浓度≤10~(-5)M时抑制细胞生长,唑来膦酸浓度为10~(-4)M时,成骨细胞吸光度随时间延长而逐渐降低,至第7天时,存活细胞已非常少,呈时间依赖性抑制细胞增殖;10~(-6)M-10~(-11) M浓度时对细胞增殖没有影响;ALP活性检测:唑来膦酸浓度为10~(-7)M、10~(-9)M及10~(-11)M时对ALP活性无影响;矿化功能测定:10~(-7)M对矿化小结形成有抑制作用(P<0.05),10~(-11)M则促进矿化功能(P<0.05),10~(-9)M;OCN、OPG、OPGL mRNA表达水平:唑来膦酸上调OPG基因的表达,下调OPGL基因的表达,使得OPG/OPGL比率增加(P<0.05);唑来膦酸在浓度为10~(-9)M和10~(-11)M时增加OCN mRNA的表达(P<0.05),10~(-7)M时与未加药组无显著差异(P>0.05)。 2、大鼠股骨头坏死模型的制备: ①成功制作大鼠创伤股骨头坏死模型:手术后大鼠股骨头关节软骨剥脱,股骨头扁平甚至塌陷;X线片显示密度不均,有囊状透光区,股骨颈变细,股骨头塌陷;组织形态学观察逐渐呈现出典型股骨头坏死不同时期病理改变。②股骨头坏死不同时期实验组空骨陷窝数量百分率高于对照组(P<0.05);实验组中骨髓腔内脂肪细胞直径、周长、面积及脂肪组织与造血组织的面积比值均高于对照组(P<0.05)。③OPG,OPGL蛋白免疫组化阳性物质呈棕褐色颗粒位于细胞质,在成骨细胞、骨基质、软骨细胞、破骨细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等均有表达。实验组OPG蛋白在股骨头坏死不同时期表达的平均光密度值(OD值)均明显低于对照组(P<0.05),呈逐渐降低的趋势;而OPGL蛋白的表达均高于对照组(P<0.05),且逐渐增高。 3、局部注射唑来膦酸及同种异体成骨细胞移植修复股骨头坏死的实验研究: ①局部注射唑来膦酸疗效比较:B组与A组相比在股骨头外观、X线片改变和骺商测量、组织学改变和破骨细胞计数、OPG/OPGL蛋白的表达以及骨组织形态计量学参数上无明显差别,治疗效果差(P>0.05)。C-G组治疗效果好于B组,与A、B组相比差异有显著性,C-G组股骨头外形保持均圆,无明显塌陷,骨小梁吸收少,破骨细胞数量降低,OPG蛋白表达增多,OPGL蛋白表达下降,骨组织相对体积大、骨小梁厚度增加、骨小梁数目多、骨小梁分离度变小,均较A组和B组明显改善(P<0.05)。组间比较:C组和D组治疗效果相当,较E-G组差(P<0.05),E-G组OPG蛋白表达较C和D组增加,OPGL蛋白表达降低,骨小梁相对体积、骨小梁数量和骨小梁分离度均较C和D组改善,有显著性差异。F和G组各项指标较E组治疗效果好,F组和G组比较无明显差异(P>0.05)。②局部注射唑来膦酸/复合细胞移植疗效比较:H组较A组和B组治疗效果好,在股骨头外形、X线片、组织学观察和OPG/OPGL蛋白表达以及骨组织形态计量学参数上均较A组和B组有改善;I组在股骨头外形的保持、组织学改变以及OPG蛋白的表达均较F组和H组进一步改善,骨小梁相对体积、骨小梁数目均较F组增多,骨小梁分离度较F组降低。 结论: 1、在低浓度范围(≤10~(-9)M)时,唑来膦酸不影响成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性,促进骨钙素基因表达,使得矿化沉积增加,表明唑来膦酸在低浓度范围不影响成骨细胞的增殖,促进成骨细胞分化和矿化功能;唑来膦酸在≤10~(-7)M时OPG/OPGL mRNA的表达比率增加,通过成骨细胞间接抑制破骨细胞分化和活性,对股骨头坏死局部破骨细胞活性增强有治疗意义,局部应用治疗股骨头坏死可行。 2、①Norman等创伤性股骨头坏死造模方法在一定程度上反映了股骨头坏死的病理变化过程,可应用于股骨头坏死的治疗研究。②股骨头坏死局部OPG、OPGL的表达水平与病变严重程度密切相关。OPG的表达随病程的延长逐渐降低;而OPGL的表达水平则相反。说明OPG的过度表达可抑制破骨细胞功能,减少骨吸收;反之则促进骨吸收。③如果提高股骨头坏死局部的OPG浓度可以抑制骨质丢失,有助于股骨头修复,可能为股骨头坏死的早期治疗提供新的途径。 3、①唑来膦酸局部注射治疗可不依赖股骨头血运恢复,直接达到股骨头坏死局部抑制破骨细胞活性和骨吸收作用,保持骨小梁结构的完整性,避免系统性用药导致的全身并发症,可控制局部给药剂量,是治疗股骨头坏死的新途径;②局部注射剂量小于全身用药累积药量的7.5%时,有随着剂量增加,治疗效果越好的趋势;推测累积用药量的7.5%可能为唑来膦酸最佳局部注射给药剂量。③唑来膦酸复合成骨细胞移植较单独细胞移植和单独局部注射唑来膦酸治疗效果均好,唑来膦酸局部注射复合成骨细胞同种异体移植,在抑制破骨细胞功能的同时提高股骨头局部的成骨能力,疗效最佳。……   
[关键词]:股骨头坏死;唑来膦酸;成骨细胞;动物模型;局部注射;同种异体移植
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南方医科大学2009年