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1α,25-(OH)_2D_3介导成骨细胞影响破骨细胞形成及活化的研究

顾建红

   骨代谢是维持骨组织不断更新,保持生命活力的基本过程,这一过程是依靠骨再建(bone remodeling)完成的。大量研究表明,动物骨营养不良的发生主要是破骨细胞(osteoclasts,OC)引起的骨吸收大于成骨细胞(osteoblasts,OB)引起的骨再建。许多研究认为,骨代谢调控因子主要通过调节OB表达核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)及骨保护素(osteoprotegerin,OPG),从而间接调控OC的形成及骨吸收功能。维生素D及其活性代谢物是动物钙、磷代谢的重要调节因素之一。然而,钙、磷及维生素D制剂的疗效却参差不齐。因此进一步理解维生素D在骨骼生理和病理学中的确切机制有助于更好地防止代谢性骨病。本文研究了不同浓度1α,25-(OH)_2D_3对体外培养OB增殖、分化及RANKL、OPG蛋白和mRNA表达的影响,并观察了RANKL对体外培养OC形成及骨吸收活性的影响,旨在阐明维生素D调节骨代谢的部分机制。 1. 1α,25-(OH)_2D_3对体外培养成骨细胞增殖、分化及周期的影响 2.5 g/L胰酶和1 g/LⅡ型胶原酶两步消化法分离3-4日龄SD大鼠乳鼠颅盖骨细胞。采用倒置显微镜、扫描电镜观察细胞形态,碱性磷酸酶(ALP)特异染色鉴定OB。在此基础上,向培养体系中添加不同浓度的1α,25-(OH)_2D_3(0 [无水乙醇溶剂对照]、10~(-9)、10~(-8)、10~(-7) mol/L)。作用24、48、72 h,MTT法测定OB增殖率、PNPP法测定ALP活性,流式细胞仪测定OB周期。结果显示,10~(-9) mol/L 1α,25-(OH)_2D_3作用24、48、72 h均促进OB增殖(P<0.05或P<0.01),抑制ALP活性(P<0.01);10~(-8)、10~(-7) mol/L作用24、48 h,OB增殖率与对照组差异不显著(P>0.05),但24 h时ALP活性均明显升高(P<0.05或P<0.01),48 h则抑制了ALP活性并使OB滞留在G2/M期(P<0.05或P<0.01);72 h时10~(-7) mol/L组OB增殖率极显著低于其余各组(P<0.01),并又使ALP活性升高(P<0.01)。说明,低浓度1α,25-(OH)_2D_3(10~(-9) mol/L)促进OB增殖,抑制其分化;中高浓度1α,25-(OH)_2D_3(10~(-8)、10~(-7) mol/L)抑制OB增殖,促进其分化,并使细胞滞留在G2/M期。 2. 1α,25-(OH)_2D_3对体外培养成骨细胞骨架、GJIC及[Ca~(2+)]_i的影响 在OB培养的基础上,不同浓度的1α,25-(OH)_2D_3(0 [无水乙醇溶剂对照]、10~(-9)、10~(-8)、10~(-7) mol/L)作用20 min、24 h,流式细胞仪测定[Ca~(2+)]_i;24、48 h,荧光显微镜观察F-actin及细胞间隙连接通讯(GJIC)。结果显示,20 min时,不同浓度1α,25-(OH)_2D_3组[Ca~(2+)]_i均显著高于对照组(P<0.05);24 h时10~(-9) mol/L组[Ca~(2+)]_i则显著低于对照组(P<0.05),其余各组间差异不显著(P>0.05),此时10~(-8)、10~(-7) mol/L组大部分细胞变得扁平,F-actin排列较对照组有序,形成应力纤维;48 h时,对照组及10~(-9) mol/L组F-actin表达减少,10~(-9) mol/L组GJIC极显著弱于对照组(P<0.01),而10~(-8)、10~(-7) mol/L组大部分细胞F-actin表达完好,GJIC均极显著强于其余两组(P<0.01)。说明,1α,25-(OH)_2D_3能够影响钙离子通道,同时低浓度1α,25-(OH)_2D_3(10~(-9) mol/L)抑制F-actin表达及细胞间隙连接通讯,中高浓度1α,25-(OH)_2D_3(10~(-8)、10~(-7) mol/L)则能维持OB形态,增强细胞间隙连接通讯。 3. 1α,25-(OH)_2D_3对体外培养成骨细胞超微形态结构的影响 在OB体外培养的基础上,不同浓度1α,25-(OH)_2D_3(0 [无水乙醇溶剂对照]、10~(-9)、10~(-8)、10~(-7) mol/L)处理48 h,扫描电镜、透射电镜观察OB超微形态结构。结果,与对照组比较,10~(-9) mol/L 1α,25-(OH)_2D_3组细胞铺展较好,表面针状突起、胞内线粒体增多;10~(-8) mol/L 1α,25-(OH)_2D_3组细胞趋于扁平,表面突起减少,变得细长,内质网增多;10~(-7) mol/L 1α,25-(OH)_2D_3组细胞外基质中大量丝状纤维连接成网状,细胞内线粒体较少,出现大量空泡及钙颗粒沉积。说明,低浓度1α,25-(OH)_2D_3(10~(-9) mol/L)能促进OB增殖,而中高浓度1α,25-(OH)_2D_3(10~(-8)、10~(-7) mol/L)抑制OB增殖,促进细胞外胶原形成及基质矿化。 4. 1α,25-(OH)_2D_3对体外培养成骨细胞RANKL及OPG表达的影响 在OB体外培养的基础上,不同浓度1α,25-(OH)_2D_3(0 [无水乙醇溶剂对照]、10~(-9)、10~(-8)、10~(-7) mol/L)作用24、48、72 h,分别采用ELISA及FQ-PCR法测定RANKL、OPG蛋白及mRNA含量。结果,10~(-8)、10~(-7) mol/L 1α,25-(OH)_2D_3较对照组、10~(-9) mol/L组显著或极显著促进RANKL蛋白及mRNA的表达(P<0.05或P<0.01);10~(-9)、10~(-8) mol/L 1α,25-(OH)_2D_3在不同时间,较对照组显著或极显著促进OPG蛋白及mRNA的表达(P<0.05或P<0.01),而10~(-7) mol/L则极显著抑制OPG mRNA表达(P<0.01);最终,10~(-9) mol/L组48 h时RANKL/OPG比值增高(P<0.05),10~(-8)、10~(-7) mol/L 1α,25-(OH)_2D_3组RANKL mRNA/OPG mRNA及RANKL/OPG比值则始终高于对照组和10~(-9) mol/L组(P<0.01)。说明,1α,25-(OH)_2D_3可剂量依赖性地上调RANKL mRNA/OPG mRNA及RANKL/OPG比值,促进OC的生成及骨吸收功能,增强骨更新。 5. RANKL对体外培养破骨细胞形成和活化的影响 分离5-6周龄ICR小鼠长骨骨髓细胞,分两阶段培养。第一阶段分三组(A、对照组[不添加任何因子];B、50 ng/mL RANKL;C、25 ng/mL M-CSF)培养3 d,进入第二阶段(Ⅰ、对照组[不添加任何因子];Ⅱ、25 ng/mL M-CSF;Ⅲ、25 ng/mL M-CSF + 50 ng/mL sRANKL)继续培养。倒置显微镜观察细胞形态,酸性磷酸酶(ACP)染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色及扫描电镜观察骨吸收陷窝,鉴定OC的生成及骨吸收活性,同时荧光显微镜观察F-actin。结果,第一阶段培养3 d,对照组和50 ng/mL RANKL组细胞均无贴壁及增殖能力,而25 ng/mL M-CSF明显促进细胞贴壁与增殖。第二阶段培养2 d,25 ng/mL M-CSF + 50 ng/mL RANKL组较25 ng/mL M-CSF组出现更多单核巨细胞,随着时间的延长单核巨细胞增多,出现2个核以上的巨细胞,且M-CSF存在的各组细胞均可表达ACP活性;培养9 d,25 ng/mL M-CSF + 50 ng/mL sRANKL组出现3个核的TRAP阳性OC(10.17±1.55个/孔),OC数极显著高于对照组(0个/孔)和25 ng/mL M-CSF组(0.67±0.69个/孔)(P<0.01)。同时,sRANKL可诱导F-actin的表达,促进骨吸收陷窝的生成。说明,RANKL在M-CSF存在时可诱导OC的生成及骨吸收活性,但OC数量仍不多。……