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促糖尿病溃疡愈合细胞/材料三维复合物的研制及应用基础研究

董荣娜

   目的:本研究以天然高分子水凝胶材料作为三维细胞支架负载转基因种子细胞,该种子细胞可高效表达血小板衍化生长因子(PDGF-BB)的中国仓鼠卵巢细胞(CHO),以构筑细胞/材料三维复合物,并应用于糖尿病大鼠皮肤溃疡模型以评价其促溃疡愈合效果。 方法:应用转基因技术,将rhPDGF-BB基因通过载体转入CHO细胞,经Zeocin抗生素筛选获得稳定表达细胞系,应用细胞荧光及免疫细胞化学染色法鉴定,酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测目的蛋白的表达量。选择天然生物高分子材料壳聚糖经N-乙酰-L-半胱氨酸(n-acetyl-l-cysteinen,NAC)修饰后合成含321.4μmol/g巯基的双硫键壳聚糖,加去离子水合成水凝胶,应用台盼蓝排斥法及MTT法通过直接法评价水凝胶对转基因CHO细胞的生物相容性,将该水凝胶负载转基因CHO细胞构成细胞/材料三维复合物,分别通过大体形态、显微镜以及扫描电子显微镜观察细胞/材料三维复合物中,水凝胶材料的孔隙大小及细胞分布情况。并应用ELISA方法测定细胞/材料三维复合物培养基上清液中rhPDGF-BB的浓度检测细胞/材料三维复合物PDGF释放水平。 通过动物的全身过敏实验、皮肤致敏实验、皮内注射实验及经静脉亚急性毒理实验,评价该水凝胶材料生物相容性。应用链脲佐菌素(STZ)诱导,制备糖尿病大鼠模型,并进一步在模型动物背部皮肤打孔制备糖尿病溃疡模型,利用转基因CHO细胞/水凝胶材料三维复合物覆盖溃疡表面,与单纯水凝胶、表皮生长因子(EGF)凝胶及空白干预对照,通过计算溃疡愈合率及分析创面修复病理变化评价该转基因细胞/水凝胶材料三维复合物促溃疡愈合效果及免疫组化法评价肉芽组织PDGF表达情况。 结果:ELISA测定结果表明转基因CHO细胞能够高效表达PDGF,与壳聚糖水凝胶复合后,PDGF蛋白表达量无任何负性影响,以及台盼蓝排斥法及MTT法显示该水凝胶材料生物相容性良好,将该水凝胶负载转基因CHO细胞构成细胞/材料三维复合物,扫描电镜显示其成互穿网络结构,孔径比较均一,细胞黏附良好。应用于糖尿病大鼠溃疡模型后,通过与各组对照显示安全性良好,对溃疡愈合有显著改善作用(P<0.05)。免疫组化结果显示各组在不同时间PDGF表达无统计学显著差异(P>0.05)。 结论:含有增强型绿色荧光蛋白的rhPDGF-BB真核表达载体,转染CHO细胞获得稳定表达rhPDGF-BB蛋白的细胞系,并应用天然生物高分子水凝胶材料制备成三维细胞支架以负载转基因种子细胞构成细胞/材料三维复合物,该支架材料生物相容性良好,孔径分布均一,利于细胞黏附生长,复合物PDGF表达水平高,可以明显改善糖尿病大鼠溃疡愈合,可以为糖尿病足溃疡治疗的进一步研究打下一定基础。……   
[关键词]:血小板衍化生长因子;CHO细胞;基因;转染;皮肤溃疡;糖尿病并发症
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:天津医科大学2009年