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牛睾丸N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及性质研究

金艳冬

   以牛睾丸为材料,通过0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5 ,内含0.2mol/L NaCl)抽提、硫酸铵分级分离获得粗酶,通过DEAE-Cellulose(DEAE-32)阴离子交换柱、Sephacry S -300凝胶过滤柱层析2次层析纯化,获得比活力为658.21U·mg~1的聚丙烯酰胺凝胶电泳单一纯N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂(NAGase,EC 3.3.1.52)。测得酶的等电点为5.54,分子量约为68.3 kDa,每个酶蛋白分子含有364个氨基酸残基,其中非极性占35.2%,碱性占16.4%,酸性占24.2%;极性不带电荷的占24.2%。该酶为单亚基酶,肽链内含有二硫键。该酶为糖蛋白,其中含糖量为3.03%(W/W)。以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖(pNP-NAG)为底物,测得该酶在0.2mol/L磷酸缓冲液(pH5.6)中催化水解pNP-NAG的最适pH为5.6,最适温度为50℃。该酶在pH 3.0~6.6区域较稳定;在55℃以下处理30 min,酶活力保持稳定。在pH5.6的条件下,酶水解pNP-NAG的米氏常数Km为0.71mmol·L~(-1),最大反应速度Vm为16.716μmol·L~(-1)·min~(-1),酶催化pNP-NAG反应的活化能Ea为64.19kJ·mol~(-1)。 金属离子对牛睾丸NAGase活力影响的研究表明:Na~+在低浓度(0~10mmol/L)下对酶的活力没有影响,在高浓度(0~1.0mol/L)下, Na~+对酶有微弱的抑制作用。Cu~(2+)对酶有微弱的抑制作用。Mg~(2+)、Ca~(2+)、Zn~(2+)、Mn~(2+)对酶有不较强的抑制作用。Mg~(2+)、Ca~(2+)、Zn~(2+)、Mn~(2+)对酶的抑制表现均为可逆非竞争性抑制机制,Mg~(2+)、Ca~(2+)、Zn~(2+)、Mn~(2+)对酶的抑制常数KI分别为75.26mmol·L~(-1)、87.37 mmol·L~(-1)、2.21 mmol·L~(-1)和41.18 mmol·L~(-1)。 研究15种氨基酸对牛睾丸NAGase活力影响的结果表明:在特定浓度范围内, L-Ile、L-Met、L-Phe、L-Ala、L-Leu、L-Pro等非极性氨基酸对牛睾丸NAGase的活力没有显著影响, L-Thr、L-Gly、L-Gln、L-Ser、L-Asn、L-His等极性氨基酸对酶活力也没有显著影响,L-Val对酶活力有微弱的激活作用, L-Arg、L-Lys对牛睾丸NAGase有不同程度的抑制作用。L-Arg对酶的抑制表现为可逆非竞争性机制, L-Arg的KI为24.22 mmol·L~(-1)。L-Lys对酶的抑制表现为可逆反竞争型机制,其KI为3.597 mmol·L~(-1)。 牛精液稀释成分青霉素钠、硫酸链霉素对酶的活力没有影响。柠檬酸钠对酶有微弱的抑制效应,氯化钾对酶有先扬后抑作用。葡萄糖和碳酸氢钠对酶有不同程度的抑制作用,葡萄糖对酶的抑制作用表现为可逆竞争性抑制机制,其KI为0.36 mol·L~(-1)。碳酸氢钠对酶的抑制作用表现为可逆反竞争性抑制机制,其抑制常数KI为7.01 mmol·L~(-1)。……   
[关键词]:牛睾丸;N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶;分离纯化;性质
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:福建农林大学2009年