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抗水貂肠炎细小病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

王建科

   水貂肠炎细小病毒(Mink enteritis virus,MEV),为细小病毒科,细小病毒属成员,是引起水貂病毒性肠炎的病原体。在自然条件下,不同品种和不同年龄的貂均有感染性,但幼貂的感染性极强。由MEV引起的水貂病毒性肠炎存在于世界各养貂国家,随着毛皮动物饲养业的发展,病毒性肠炎已经成为危害水貂饲养业的三大疫病之一,给养貂业带来巨大的经济损失。 取本实验室分离保存的水貂肠炎细小病毒SMPV-11株接种健康水貂,感染后5 d采集肠道内容物分离纯化病毒,经负染电镜检查可见20~24 nm的病毒粒子,血凝试验测定其血凝效价达2~(13)。将纯化的病毒免疫4~6周龄雌性BALB/c小鼠,用建立的间接ELISA方法检测小鼠血清效价达1:2.56×10~5时,取其脾细胞与对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,采用有限稀释法进行3~4次的亚克隆直到100%阳性为止,最终筛选得到8株稳定分泌抗水貂肠炎细小病毒SMPV-11株单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名D3、H5、F5、F4、A9、B7、H11和H8。 经间接ELISA方法测定8株单抗腹水效价分别在1:6.4×10~3和1:2.56×10~4之间,特异性试验鉴定8株单抗均不与犬瘟热病毒(CDV)、阿留中病毒(ADV)、犬腺病毒(CAV)发生交叉反应,但与水貂肠炎细小病毒(MEV)、犬细小病毒(CPV)和猫泛白细胞减少症病毒(FPV)呈特异性反应,亚类鉴定8株单抗均为IgG1和lgG2a类型,其杂交瘤染色体数为105左右,间接免疫荧光试验鉴定,8株单抗均能使接毒的F81细胞产生亮绿色荧光,而免疫印迹试验结果显示F5、F4、A9、B7和H8在约63.5 ku处可见特异性反应带,其余3株单抗则未见特异性反应带,中和试验结果显示F5中和效价为1:27,A9中和效价为1:23,而其余6株均无中和能力,HI试验显示最高HI效价可达2~(11)。此种单克隆抗体的获得为MEV的研究、快速诊断方法的建立奠定了基础。 利用F5杂交瘤细胞株的小鼠腹水单克隆抗体和貂抗MEV高免血清建立了检测MEV的单抗—抗原—多抗—酶标二抗的双抗体夹心ELISA方法。经测定,McAb的最适包被浓度为241.7μg/mL(1:20倍稀释),貂抗MEV高免血清的最适工作浓度为4.676μg/mL(1:1 600倍稀释),其检测灵敏度为2.5μg/mL。该检测方法与常见的水貂的几种传染病病原无交叉反应,通过对已知MEV阳性、阴性抗原的检测结果表明,具有较高的符合率。双抗体夹心ELISA方法的建立为生产上提供了一种更快速、简单、灵敏、特异的MEV检测方法。……   
[关键词]:水貂肠炎细小病毒;单克隆抗体;制备;双抗体夹心ELISA;建立
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国农业科学院2009年