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姜黄素抗肝纤维化作用的实验研究

张虎平

   目的:肝纤维化(hepatic fibrosis)是指肝细胞发生坏死或炎症刺激时,肝内纤维结缔组织增生与分解失衡,从而在肝内异常沉积的病理过程。肝纤维化是多种慢性肝病的重要病理特征和发展至肝硬化的必经阶段,也是唯一在一定情况下可被逆转的阶段。如若病因持续存在,肝纤维化逐渐加重,肝小叶及血管等逐渐被改建,肝脏的正常结构遭到破坏,中心静脉区和汇管区出现间隔、假小叶形成,即发展为不可逆转的肝硬化。肝纤维化的形成涉及多种细胞、细胞因子及肝组织内细胞外基质的变化。其中肝星状细胞(HSC)激活并转化为肌成纤维细胞是肝纤维化发生、发展的核心环节,各种致肝纤维化因素均把HSC作为最终靶细胞,促使其转化为肌成纤维细胞(myofibroblast -like,MFBLC)而导致肝纤维化的发生。肝纤维化常见病因在我国以乙型或丙型病毒性肝炎为最多, 20%~30%慢性丙型肝炎患者最终出现严重的肝纤维化或肝硬化病变。在西方国家以慢性酒精中毒为主要病因,其中60%~70%最终可发展为肝硬化。关于肝纤维化机制及对其防治的研究,近年来已成为国内外生物学、医学研究的热点之一。目前肝纤维化的治疗仍处在探索阶段,尚无特效药问世,而抗肝纤维化中药药物治疗越来越显示其独特优势,其研究已进入细胞分子水平,少数已深入到细胞内信息控制水平,其作用机制为多环节、多途径、多靶点。姜黄素(curcumin)是从姜科姜黄属(Curcuma L)植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的一种天然有效成分,大量研究证明,姜黄素具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、清除自由基、抗微生物以及对心血管系统、消化系统等多方面药理作用。 本研究采用四氯化碳腹腔内注射制备小鼠肝纤维化模型,应用姜黄素灌胃进行干预治疗,以免疫组化和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法研究姜黄素对小鼠肝纤维化及肝组织中caspase-3蛋白和基因表达情况的影响,探讨姜黄素对肝纤维化的阻断作用;以不同浓度姜黄素对体外培养的大鼠肝星状细胞进行干预,探讨姜黄素对肝星状细胞的抑制,促使其凋亡,阻止肝纤维化的进展,以进一步揭示中医药在防治肝纤维化中的作用,为有效防治肝纤维化提供新的思路。 方法:选用8周龄健康雌性C57BL6/J小鼠40只,体重18~22g,小鼠适应性喂养一周后,按随机数字表法将40只小鼠随机分为四组:正常对照组)、姜黄素预防组、姜黄素治疗组和肝纤维化模型组。除正常对照组外,其余各组按5ul/g体重给予10% CC14橄榄油溶液(即CC14与橄榄油以1∶9混合)腹腔注射,每周2次,共8周。姜黄素预防组和姜黄素治疗组分别从第1、7周起按50 mg/kg体重给予姜黄素灌胃处理,每周3次。8周后在深度麻醉下处死各组动物,留取血清及肝组织标本。血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT),采用日本Olympus AU 2700全自动生化分析仪测定;透明质酸(hyaluronic acid,HA)采用智能放免γ测量仪自动检测计算结果;肝组织病理学变化采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色、Masson胶原染色观察;肝组织α-SMA、caspase-3表达采用免疫组织化学染色方法检测;肝组织中caspase-3 mRNA的表达状态采用RT-PCR法检测分析;体外培养的肝星状细胞用用不同浓度姜黄素分别处理HSC-T6细胞24h后,采用流式细胞技术检测细胞凋亡和细胞周期分布情况。 结果:1.小鼠一般情况:正常组小鼠精神状态良好,毛发整齐有光泽,活动自由,食欲好,每周体重增长正常。模型组大鼠随着四氯化碳注射时间的延长,变得易激惹,个别具有攻击性,毛发失去光泽,紊乱,精神萎靡,食欲下降,体重增长慢或不增。而姜黄素治疗组随着给药天数的增加,造模时的症状逐渐得到改善。8周末,与正常组相比,预防组、对照组、模型组体小鼠体重明显下降,差异有统计学意义(P值均<0.05)。与模型组比较,预防组和治疗组小鼠体重有所增加,差异有统计学意义(P值均<0.05)。预防组和治疗组小鼠体重相比差异无统计学意义(P>0.05)。 2.血清ALT、HA水平改变:实验小鼠血清ALT水平依次为:模型组>姜黄素预防组>姜黄素治疗组>正常组(168.62±13.75 U/L、104.86±11.68 U/L、82.98±9.57U/L、47.91±8.08 U/L,P<0.05),各组差异均有统计学意义;HA水平依次为:模型组>治疗组>预防组>正常组(1609.95±125.91ng/ml、1290.26±127.59ng/m、953.39±98.48ng/ml、759.10±77.31ng/ml,P<0.05),各组差异均有统计学意义。 3.肝脏病理学变化:正常组小鼠肝组织中肝小叶结构完整,肝索排列整齐,无炎细胞浸润,肝小叶间未见纤维组织增生,无假小叶形成。模型组小鼠肝组织中肝小叶结构被破坏,肝索排列紊乱,有炎细胞浸润,可见肝细胞水肿和脂肪变性,汇管区有大量纤维胶原增生,形成纤维分隔,有假小叶形成。预防组仅见少量炎细胞浸润,汇管区有少量纤维组织增生,无假小叶形成。治疗组炎症、纤维化程度较预防组重但明显轻于模型组。 4.α-SMA免疫组织化学染色:正常组仅血管壁可见少量α-SMA阳性表达,胆管壁不表达。模型组α-SMA阳性表达细胞明显增多,主要分布于、门静脉、汇管区血管壁、纤维间隔,少量表达于邻近的肝实质窦周间隙、偶见于中央静脉壁,呈长椭圆形或梭行。与正常组相比,预防组、治疗组α-SMA阳性表达有所增加,但明显少于模型组,各组水平依次为:模型组>治疗组>预防组>正常组(8.21±1.48、6.25±1.69、4.78±1.32、1.51±0.95,P <0.05),差异具有统计学意义。 5.小鼠肝组织caspase-3蛋白表达的情况:caspase-3免疫组化染色阳性细胞为胞浆内表达棕黄色颗粒。正常组小鼠仅中央静脉、肝窦内有少量阳性分布。模型组小鼠肝组织中可见明显表达,主要表达在肝细胞浆、中央静脉、肝窦内及纤维间隔。与正常组相比,预防组、治疗组的肝组织caspase-3蛋白阳性表达有所增加,但明显少于模型组,各组水平依次为:模型组>治疗组>预防组>正常组(9.88±1.32、7.91±1.28、2.62±0.89、0.62±0.17,P<0.05),差异有统计学意义。 6.肝组织caspase-3 mRNA表达情况:与正常组相比,模型组实验动物肝组织中caspase-3 mRNA表达明显上升,预防组、治疗组表达多于正常组而少于模型组,水平依次为:模型组>治疗组>预防组>正常组(0.441±0.013、0.374±0.010、0.310±0.010、0.203±0.006,P<0.05),差异具有统计学意义。 6.姜黄素作用于HSC-T6细胞后,可诱导典型的细胞凋亡形态变化,如细胞胞体缩小、胞质浓缩、胞核向外呈锐角突起、染色质高度浓缩、核仁边集于核膜下或呈新月形,有的细胞出现核固缩、核碎裂以及凋亡小体等典型细胞凋亡的形态特征。流式细胞分析结果也显示,curcumin能使HSC-T6细胞发生凋亡和生长周期阻滞,处理24h后,凋亡率明显增加,且呈浓度依赖性;G2/M期细胞明显增加,S期细胞明显减少,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论: 1.小鼠经四氯化碳腹腔注射8周可诱导具有典型肝纤维化特征的动物模型,此模型符合人类肝纤维化发病的病理学特点。 2.姜黄素可改善肝功能及肝组织纤维、炎症坏死程度,具有预防和治疗肝纤维化的作用。 3.姜黄素可抑制肝组织caspase-3 mRNA及蛋白的表达,减轻肝纤维化和肝组织炎症,阻止肝纤维化的进展,提示其在治疗肝纤维化中存在很大的前景。 4.姜黄素能抑制体外培养的大鼠HSC-T6生长,促进细胞凋亡,使细胞周期阻滞在G2/M期,其作用具有明显的剂量相关性。……   
[关键词]:肝纤维化;发病机制;姜黄素;caspase-3;肝星状细胞
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:河北医科大学2009年