手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

阿魏酸的降解作用规律和机理研究及其在药物质量控制中的应用

任淑萌

   中医药是中华民族灿烂文明中重要的组成部分之一,经过千百年的使用,其功能和疗效已经得到人们的普遍认同。目前临床上中药的应用日益广泛,新品种、新剂型也不断涌现,然而近年来中药不良反应的报道逐年增多,甚至某些复方中药制剂还造成了严重的不良后果。这些问题主要起源于中药(特别是植物药)化学成分复杂,很难对其未知成分一一加以控制;即使是已知活性的指标成分,也不乏稳定性较差的种类,例如虎杖、大黄等药材的成分白藜芦醇及其苷在物理及化学因素的诱导下发生几何异构现象。因此,不稳定成分降解作用的规律和机理探讨,降解产物的毒性和代谢参数研究,乃至含有不稳定成分的品种或制剂的上市后再评价将在有效地控制药物质量、保证药品的安全性和有效性方面具有重要意义。 本课题以阿魏酸作为这类成分的代表物,它具有抗氧化、抗炎镇痛、清除自由基等作用,常常作为多种中药制剂的有效或指标成分,用于评价和控制其药物的质量;其钠盐(阿魏酸钠)具有抗肿瘤、抗肝纤维化及治疗心、脑血管疾病等药理作用,并在临床上得到了广泛的使用。而最近有研究表明阿魏酸以溶液状态存在时性质不稳定,容易受外界和溶液环境等因素的影响。在临床使用中,阿魏酸还曾引起了过敏反应,因此,其稳定性受到人们越来越多的重视和关注。本课题选取阿魏酸作为研究对象,为含有这类成分的质量研究提供新的方法和思路。 本研究采用了现代分析手段(LC、DAD、MS、1H-NMR)和分离技术(固相萃取、制备液相),对阿魏酸降解作用进行了考察研究,从而为该类药物的稳定性试验和研究提供了手段和理论依据。研究结果表明:(1)建立分析测定阿魏酸的液相色谱分析方法,通过研究比较温度、光线、浓度、溶液pH等因素对阿魏酸稳定性的影响,表明阿魏酸受光线条件影响显著,其水溶液对光线较为敏感;(2)阿魏酸溶液置于强光下照射,采用柱色谱和制备液相色谱法分离得到光降解产物,经DAD、MS、1H-NMR鉴定后确定其光降解产物为顺式阿魏酸;(3)采用液相色谱分析方法以外标法同时测定反式和顺式阿魏酸的浓度,研究阿魏酸的光致顺反异构化反应属于1-1级对峙反应,测定4℃、23℃、40℃、60℃下的反应速率常数,得到正、逆向反应的活化能分别为20.51KJ·mol-1,35.68KJ·mol-1;(4)以口服给药和静脉注射两种方式,按《中国药典》2005版二部附录ⅪC方法,分别给予两组小鼠已达到平衡时的顺、反阿魏酸混合溶液(其中反式阿魏酸相当于注射剂的半数致死量),初步证实其未见急性毒性反应,但是否会导致长期毒性或其它毒副作用还有待于进一步研究;(5)本文采用中空纤维离心超滤法测得的反式阿魏酸的血浆蛋白结合率测定结果与采用平衡透析法的结果一致。在同时研究顺、反式两种阿魏酸时,反式、顺式阿魏酸与血浆蛋白结合率为23.8%和31.0%,测定结果区别来自两者本身的极性差异,但经t检验表明,顺、反式阿魏酸的蛋白结合率差异并不显著。 一、阿魏酸降解作用规律研究及机理探讨 (一)阿魏酸与降解产物的分析方法及其稳定性影响因素的研究 目的:考察比较温度、光线、浓度、溶液pH等因素对阿魏酸稳定性的影响,研究确定阿魏酸降解作用的主要因素。 方法:建立高效液相色谱法(HPLC)分离分析阿魏酸及其降解产物,采用Hypersil ODS C18色谱柱(4.6mm×150mm,5μm),流动相为甲醇:乙腈:1%冰醋酸(15:10:75);流速:1.0 ml·min-1;检测波长:320 nm;柱温:室温。测定阿魏酸的剩余浓度,拟合动力学方程并计算降解速率。 结果:阿魏酸在8.00~1.02×103μg·mL-1范围内线性关系良好,阿魏酸的方法回收率不低于99.5%;测定不同浓度阿魏酸的剩余浓度,以其均值与时间按零级、一级、二级化学反应动力学方程式进行曲线拟合均符合一级动力学反应;阿魏酸在pH值趋于中性时稳定性较好,在酸性环境下次之,碱性环境中最差;阿魏酸降解速率常数随温度升高而增大,但总体上速率常数均较小;降解速率常数与光照强度成正比,但在避光条件下其降解率很低。 结论: HPLC测定阿魏酸的含量方法简单、快速、准确;比较浓度、pH、温度和光强度等影响因素,阿魏酸对光线敏感,光是影响其稳定性的主要因素。 (二)阿魏酸主要降解产物的分离、鉴定及性质研究 目的:确定阿魏酸的主要降解产物的结构,并研究其性质。 方法:光强化条件下制备阿魏酸降解产物,采用柱色谱和制备液相色谱分离其产物,经DAD、MS、1H-NMR进行结构鉴定。 结果:液质联用测定结果表明其降解产物具有与阿魏酸相同的m/z,均为193;由1H-NMR图谱上H的δ推断其降解产物为顺式阿魏酸;LC-DAD提供的紫外色谱图显示降解产物的吸收带发生蓝移,为其鉴定结构提供了依据。 结论:阿魏酸光降解后制备得到黄色油状液体,经鉴定认为它是阿魏酸的顺式异构体。 (三)阿魏酸光转化动力学研究及光致异构化规律和机理探讨 目的:研究光照条件下阿魏酸转化动力学规律,揭示阿魏酸光致异构化作用的机理 方法:按第一部分“色谱条件”的HPLC分析方法,同时测定溶液中反式和顺式阿魏酸含量,求出该转化反应正向、逆向反应速率常数,计算反应平衡常数并代入阿仑尼乌斯(Arrlenius)经验公式求出正、逆向反应活化能。 结果:经拟合阿魏酸光致异构化反应的两个方向都能够发生且均符合一级反应,此反应属于1-1级对峙反应;采用外标法分别测定23℃时阿魏酸溶液中两种物质的浓度,并计算出正、逆向反应速率常数分别为1.569×10-4 (μs)-1和1.590×10-4 (μs)-1;正、逆向反应的活化能分别为20.51kJ·mol-1和35.68kJ·mol-1;在光照条件下,这一反应需要经过一个中间过渡态进而发生顺反异构转化的。 结论:通过测定阿魏酸光致异构化过程中反式和顺式阿魏酸含量,计算出该反应的动力学参数(光致异构化速率常数、平衡常数和活化能),研究得出了阿魏酸光致异构化的规律和作用机理。 二、顺式阿魏酸异常毒性及蛋白结合率的初步研究 (一)顺式阿魏酸的异常毒性研究 目的:阿魏酸钠制剂中存在降解产物顺式阿魏酸时,考察其急性毒性反应。 方法:以口服给药和静脉注射两种方式按《中国药典》2005版二部附录ⅪC方法进行异常毒性试验,观察两组各10只小鼠的即时反应,仍按正常条件饲养一周,并分别观察和记录它们的毒性反应。 结果:以灌胃和尾静脉注射两种方式给药后,观察小鼠一周内反应,记录下每组10只小鼠的各自的即时反应,在一周内两组小鼠均未出现死亡现象。 结论:分别给予两组小鼠已达到平衡时的顺、反阿魏酸混合溶液(其中反式阿魏酸相当于注射剂的半数致死量),均未见出现急性毒性反应,初步认为有降解产物顺式阿魏酸存在时未见明显异常毒性,但其是否会产生长期毒性或其他毒副作用还有待于进一步考察。 (二)中空纤维离心超滤法测定顺、反式阿魏酸与大鼠血浆的蛋白结合率 目的:测定顺、反式阿魏酸的大鼠血浆蛋白结合率,比较两种异构体在体内特征上的异同,并建立适用于不稳定药物血浆蛋白结合率的测定方法。 方法:建立HPLC测定血浆中阿魏酸两种异构体的分析方法,采用Hypersil ODS C18色谱柱(4.6mm×150mm,5μm),(大连依利特科学仪器有限公司);流动相为甲醇:乙腈:1%冰醋酸(12:10:78);流速:1.0 ml·min-1;检测波长:320 nm;柱温:室温。利用中空纤维离心超滤法分别测定阿魏酸的两种异构体在血浆中游离浓度,计算两者血浆蛋白结合率。 结果:血浆中反式与顺式阿魏酸分别在4.00×10-2~2.56μg·mL-1、3.10×10-2~1.94μg·mL-1范围内线性关系良好;反式与顺式阿魏酸的回收率不低于95.1%和94.1%;单独研究反式阿魏酸,它在大鼠血浆中的蛋白结合率为24.3%,顺、反阿魏酸同时研究时,反式及顺式阿魏酸与血浆蛋白结合率为23.8%和31.0%,测定结果微小的差异来自两者本身的极性,经t检验表明,顺、反式阿魏酸的蛋白结合率差异并不显著。 结论:本文采用中空纤维离心超滤法测得的反式阿魏酸的血浆蛋白结合率测定结果与采用平衡透析法的结果一致,说明该方法测定结果准确,而且其设备简单,生物样品量少,适合于不稳定药物血浆蛋白结合率的研究。……