手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

以“浊毒”立论论治肝纤维化的理论初探及实验研究

王丽

   肝纤维化(Hepatic fibrosis,HF)是指各种致病因素所引起的肝脏慢性损害和炎症,是多种慢性肝病共同的病理基础,是肝脏细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成和降解失衡、导致其过度沉积的结果,也是慢性肝炎进一步向肝硬化、肝癌发展的重要环节。 以往的研究局限于将肝纤维化归为一种被动的静止状态,随着分子生物学研究方法和技术的日新月异,人们在肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)活化、多种动物模型的建立、细胞因子信号传导通路、基因靶向治疗等方面取得了较大的进展。转化生长因子-β1(transforming growth factor- beta1-1,TGF-β1)、基质金属蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibit of metallo -Proteinase,TIMP-1)、ECM成分等已经成为研究的热点。 目前研究的抗纤维化药物主要包括细胞保护类、HSC活化抑制类、细胞因子活性类、抑制ECM合成及分泌类、促进ECM降解类、中药单体和复方等。但肝纤维化是一个复杂的病理过程,临床上至今缺乏确切特效的抗纤维化药物与方法。 中医药治疗疾病具有多方位、多环节、多靶点的特点,在肝纤维化的预防和治疗方面有其独特的优势。在当前形势下,寻找能够改善HF状态的中药或者中药提取物,并对其相关机制进行探索,不仅有利于中药现代化的研究,也将对HF治疗产生深远的影响。 我们通过观察化浊解毒益气方对猪血清诱导的HF大鼠的干预研究,探讨肝纤维化的病理机制,为肝纤维化的治疗提供理论及实验依据。 目的:以“浊毒”理论为依据探讨其在肝纤维化治疗中的地位,探讨化浊解毒益气方对肝纤维化大鼠的影响及其可能的作用机制。主要内容包括以“浊毒”立论论治肝纤维化的理论初探;化浊解毒益气方对肝纤维化大鼠血清AST、ALT、ALB、TP和病理形态学的影响;化浊解毒益气方对肝纤维化大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型胶原和病理形态学的影响;化浊解毒益气方对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1表达的影响;化浊解毒益气方对肝纤维化大鼠肝组织TIMP-1表达的影响。 方法:清洁级Wistar大鼠60只,雄性,体重200~220g。适应性喂养一周后随机分为正常对照组、模型对照组、秋水仙碱预防组(简称西药预防组)、化浊解毒益气方预防组(简称中药预防组)、秋水仙碱治疗组(简称西药治疗组)、化浊解毒益气方治疗组(简称中药治疗组)六组,每组10只。除正常对照组外,其余各组均采用未灭活的猪血清腹腔注射,每次0.5ml/只,每周两次,连续8周。秋水仙碱预防组和中药预防组于造模的同时给药,每天上午灌胃一次,每次2ml,连续12周。秋水仙碱治疗组和中药治疗组于造模的第8周末给药,每天上午灌胃一次,每次2ml,连续4周。正常对照组给予等量生理盐水。 各组分别于造模的第8周末、第12周末处死5只大鼠,腹主动脉取血,分离血清,测定各组大鼠干预后血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨基转移酶(AST)、白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CⅣ)水平。其中ALT、AST用赖氏法测定;ALB用溴甲酚绿比色法测定;TP用双缩脲法测定;HA、LN、PCⅢ、CⅣ用放射免疫分析法测定。留取大鼠肝组织,采用苏木精-伊红染色和Masson染色(胶原纤维特殊染色法)观察肝组织病理形态学的变化。采用免疫组化和RT-PCR技术测定肝组织TGF-β1、TIMP-1蛋白和mRNA表达情况。所得数据经过整理,采用SPSS统计软件进行t检验或方差分析。 结果: 1化浊解毒益气方对肝纤维化大鼠血清AST、ALT、ALB、TP和病理形态学的影响 1.1化浊解毒益气方对肝纤维化大鼠血清AST、ALT、ALB、TP的影响 与正常对照组相比,模型组大鼠血清ALT、AST升高,ALB、TP降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组相比,第8周末,西药预防组和中药预防组各组大鼠血清ALT、AST下降,TP、ALB升高,差异有统计学意义(P<0.05),且中药预防组优于西药预防组(P<0.05)。12周末,各药物处理组大鼠血清ALT、AST下降,TP、ALB升高,差异有统计学意义(P<0.05),且中药预防组优于西药预防组,中药治疗组优于西药治疗组(P<0.05)。但是西药处理组之间、中药处理组之间各组大鼠血清指标差异均无统计学意义(P>0.05)。 1.2化浊解毒益气方对肝纤维化大鼠肝脏病理形态学的影响 正常组肝小叶结构完整,肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列,无变性坏死,无纤维组织增生。模型组肝小叶结构严重破坏,肝细胞广泛脂肪变性、坏死伴炎性细胞浸润,纤维组织大量增生,个别动物可见假小叶形成。第8周末,各药物预防组肝小叶结构受损轻,可见肝细胞脂肪变性及炎性细胞浸润,但较模型组显著减轻。胶原纤维增生较模型组减轻,主要散在于肝血窦和disse间隙内,无假小叶形成,中药预防组优于西药预防组。第12周末,各药物干预组肝脏损伤程度均较模型组轻,西药治疗组病理改变与西药预防组相似,中药治疗组病理改变与中药预防组相似。且中药预防组优于西药预防组,中药治疗组优于西药治疗组。 2化浊解毒益气方对肝纤维化大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型胶原和病理形态学的影响 2.1化浊解毒益气方对肝纤维化大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型胶原的影响 与正常对照组相比,模型组大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型胶原升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组相比,第8周末,西药预防组和中药预防组各组大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型胶原下降,差异有统计学意义(P<0.05),且中药预防组优于西药预防组(P<0.05)。12周末,各药物处理组大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ型胶原下降,差异有统计学意义(P<0.05),且中药预防组优于西药预防组,中药治疗组优于西药治疗组(P<0.05)。但是西药处理组之间、中药处理组之间各组大鼠血清指标差异均无统计学意义(P>0.05)。 2.2化浊解毒益气方对肝纤维化大鼠病理形态学的影响 正常组肝小叶结构完整,肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列,无变性坏死,无纤维组织增生。模型组肝小叶结构严重破坏,肝细胞广泛脂肪变性、坏死伴炎性细胞浸润,绿色纤维组织大量增生,个别动物可见假小叶形成。8周末,各预防组肝小叶结构受损轻,可见肝细胞脂肪变性及炎性细胞浸润,但较模型组显著减轻。胶原纤维增生较模型组减轻,主要散在于肝血窦和disse间隙,无假小叶形成。且中药预防组优于西药预防组。12周末,各药物干预组肝脏损伤程度均较模型组显著减轻,且中药预防组优于西药预防组。中药治疗组优于西药治疗组。 3化浊解毒益气方对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1表达的影响 3.1化浊解毒益气方对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1蛋白表达的影响。 正常组大鼠肝组织见少许TGF-β1阳性表达细胞,模型组大鼠肝组织中表达的阳性细胞比例显著高于正常组,表现为不均匀的黄褐色颗粒状物。与正常对照组相比,模型组大鼠肝组织TGF-β1蛋白表达增高,差异有统计学意义(P<0.05)。8周末,与模型对照组相比,西药预防组和中药预防组两组大鼠肝组织TGF-β1蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.05),且中药预防组优于西药预防组(P<0.05)。12周末,各药物干预组大鼠肝组织TGF-β1蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.05),且中药预防组优于西药预防组(P<0.05),中药治疗组优于西药治疗组。但是西药预防组与治疗组之间、中药预防组和治疗组之间各组大鼠肝组织TGF-β1蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。 3.2化浊解毒益气方对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β1mRNA表达的影响 与正常对照组相比,模型组大鼠肝组织TGF-β1mRNA表达增高,差异有统计学意义(P<0.05)。8周末,与模型对照组相比,西药预防组和中药预防组两组大鼠肝组织TGF-β1mRNA表达下降,差异有统计学意义(P<0.05),且中药预防组优于西药预防组(P<0.05)。12周末,各药物干预组大鼠肝组织TGF-β1mRNA表达下降,差异有统计学意义(P<0.05),且中药预防组优于西药预防组(P<0.05),中药治疗组优于西药治疗组。但是西药预防组与治疗组之间、中药预防组和治疗组之间各组大鼠肝组织TGF-β1mRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05)。 4化浊解毒益气方对肝纤维化大鼠肝组织TIMP-1表达的影响 4.1化浊解毒益气方对肝纤维化大鼠肝组织TIMP-1蛋白表达的影响 正常组大鼠肝组织见少许TIMP-1阳性表达细胞,模型组大鼠肝组织中表达的阳性细胞比例显著高于正常组,表现为不均匀的黄褐色颗粒状物。与正常对照组相比,模型组大鼠肝组织TIMP-1蛋白表达增高,差异有统计学意义(P<0.05)。8周末,与模型对照组相比,西药预防组和中药预防组两组大鼠肝组织TIMP-1蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.05),且中药预防组优于西药预防组(P<0.05)。12周末,各药物干预组大鼠肝组织TIMP-1蛋白表达下降,差异有统计学意义(P<0.05),且中药预防组优于西药预防组(P<0.05),中药治疗组优于西药治疗组。但是西药预防组与治疗组之间、中药预防组和治疗组之间各组大鼠肝组织TIMP-1蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。 4.2化浊解毒益气方对肝纤维化大鼠肝组织TIMP-1mRNA表达的影响 与正常对照组相比,模型组大鼠肝组织TIMP-1mRNA表达增高,差异有统计学意义(P<0.05)。8周末,与模型对照组相比,西药预防组和中药预防组大鼠肝组织TIMP-1mRNA表达下降,差异有统计学意义(P<0.05),且中药预防组优于西药预防组(P<0.05)。12周末,各药物干预组大鼠肝组织TIMP-1mRNA表达下降,差异有统计学意义(P<0.05),且中药预防组优于西药预防组(P<0.05),中药治疗组优于西药治疗组。但是西药预防组与治疗组之间、中药预防组和治疗组之间各组大鼠肝组织TIMP-1mRNA表达差异均无统计学意义(P>0.05)。 结论: 1“浊毒”理论的提出对肝纤维化的中医病因病机分析具有重要意义,在肝纤维化的诊断和治疗中,占有重要的地位。 2化浊解毒益气方能有效改善肝纤维化大鼠肝组织病理改变、减轻肝细胞的损伤,减少胶原纤维的生成,从而发挥其抗纤维化的作用。 3化浊解毒益气方能显著降低大鼠血清AST、ALT含量,升高TP、ALB含量,减轻肝细胞的损伤,保护肝功能,通过保肝、抗炎而发挥其抗纤维化的作用。 4化浊解毒益气方能显著降低大鼠血清HA、LN、PCⅢ型胶原、Ⅳ型胶原含量,减少细胞外基质的生成,从而发挥其抗纤维化的作用。 5化浊解毒益气方能显著降低大鼠肝组织TGF-β1蛋白和mRNA的表达,抑制肝星状细胞的活化,通过调控相关细胞因子生物作用,促进细胞外基质的降解。 6化浊解毒益气方能显著降低大鼠肝组织TIMP-1蛋白和mRNA的表达,通过调节MMPS和TIMPS的失衡,促进异常合成的细胞外基质的降解,减少细胞外基质的过度沉积。……   
[关键词]:浊毒理论;化浊解毒益气方;肝纤维化;转化生长因子-β1;基质金属蛋白酶抑制因子-1
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:河北医科大学2009年