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Eimeria tenella马杜霉素耐药株与同源敏感株不同阶段蛋白质的差异分析

王秀君

   柔嫩艾美尔球虫(Eimeria tenella)是严重危害养鸡业的全球性鸡球虫病原之一。目前,球虫病的控制主要依赖于药物预防,但是由于抗球虫药的广泛使用,尤其是抗球虫药作为饲料添加剂长期拌料使用,使鸡球虫不可避免地产生了耐药性,因而揭示球虫耐药性产生的机理对球虫病的预防及开发新的治疗药物具有十分重要的现实意义。球虫与其他许多物种不同,有着复杂的生活史,其卵囊期、胞子期、及裂殖体期具有不同的型态,其生理结构也有巨大的差异,并且具有不同的蛋白质及酶表达。对这些蛋白进行研究为球虫耐药性机理的深入探讨有着重要的意义。有关艾美尔球虫的蛋白质组研究处于刚起步阶段,国内外有关报道尚不多见。 本试验利用双向电泳技术找出了E.tenella马杜霉素耐药株与同源敏感株在第二代裂殖、未孢子化卯囊、孢子化卵囊时期表达差异较大的蛋白,采用质谱技术对这些差异蛋白进行鉴定,结合生物信息学检索对它们的功能进行初步研究。主要内容: 1.E.tenella马杜霉素耐药株与同源敏感株不同阶段蛋白电泳的比较研究 用E.tenella马杜霉素耐药株及其同源敏感株分别感染2周龄无球虫罗曼小公鸡,分别从鸡盲肠和粪便收取两个虫株第二代裂殖子、未孢子化卵囊、孢子化卵囊4℃下保存备用。采用EDAE凝胶纯化球虫,对比了TCA/丙酮沉淀法、刘文江法及直接研磨高速离心法的效果,选择了直接研磨高速离心法结合HiTrap Desalting脱盐,冷冻干燥系统浓缩蛋白的E.tenella双向电泳样品制备方案,解决了困扰双向电泳研究的盐离子浓度偏高和蛋白浓度控制的问题。 将制备的蛋白样品进行SDS-PAGE,凝胶经考马斯亮蓝染色,利用Imagemaster VDS软件系统对结果进行分析。结果显示,在孢子化阶段马杜霉素耐药株与敏感株相比有一条高表达的蛋白质带,其分子量约为21.5kD,相对含量23.0%;第二代裂殖子及未孢子化卵囊阶段的蛋白质相对含量没有明显差异。进一步研究,试验采用双向电泳技术蛋白质上样量150μg,pH3-1017cm IPG干胶条(BIO-RAD)用PROTEAN IEF Cell等电聚焦仪进行等电聚焦,设定总聚焦60,000Vh,平衡后转移至PROTEANⅡxi Cell电泳槽以0.5mm 12%均匀胶进行垂直电泳SDS-PAGE,在对凝胶银染后,用Image Master~(TM) 2D Elite软件对结果进行分析。结果显示:E.tenella马杜霉素耐药株与同源敏感株的第二代裂殖子、未孢子化卵囊、孢子化卵囊2-DE图谱分别识别到900±73、900±25、200±14、200±11、200±51、200±43个蛋白点,其中大部分蛋白点分布于15~100kD,等电点3.5~9.5之间。对比这些蛋白点发现马杜霉素耐药株与敏感株间平均匹配率约88%~92%且三个阶段均有表达差异的蛋白点,它们主要分布在分子量21~28KD、35~45KD,66~90KD等电点3.5~8.0之间的区域。 2.E.tenella马杜霉素耐药株与同源敏感株差异蛋白MALDI-TOF MS分析 选取E.tenella马杜霉素耐药株与同源敏感株3阶段2-DE图谱中15个分离明显的差异蛋白点(其中马杜霉素株特异点9个,同源敏感株特异点6个),进行MAIDI-TOF-MS肽指纹图谱分析,经在线Mascot软件(http://www.Matrixscience.com)在NCBInr检索鉴定出12个蛋白和3个猜想蛋白。分析结果显示,在这15种差异表达的蛋白中,大部分属于蛋白酶类,与细胞内糖代谢、多胺代谢、能量代谢等相关,如endonuclease V(核酸内切酶V)、carboxy-lyase(羧酸分解酶)、porphobilinogen deaminase(胆色素源脱氨基酶)、beta-N-acetylglucosaminid-aseisoform A(β-N-乙酰氨基己糖糖苷酶);有些与免疫相关,如免疫蛋白1C2和A6、LT2(ATP酶分子伴侣)、ATCC 49188(分泌蛋白)、ANA-3(染色体分离蛋白);有些与细胞信号转导有关,如HTCC2150(ABC转运蛋白)、RAB36(RAS家族转运蛋白);有些参与虫体的构成,如Strongylocentrotus purpuratus(肌动蛋白集束)。其中在马杜霉素耐药株中特异表达蛋白DSM3645、SD-21、ATCC 49188及Strongylocentrotus purpurams和高表达蛋白endonucleaseV、HTCC2150、RAB36、ANA-3及LT2主要分布在孢子化和第二代裂殖子阶段,推测耐药株球虫主要在此两阶段产生某些代谢机制来抵御药物的侵袭,这将对进一步研究球虫的免疫耐受机理奠定了基础。……   
[关键词]:柔嫩艾美尔球虫;E.tenella马杜霉素耐药株;蛋白质;双向电泳;MALDI-TOF MS分析
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西南大学2009年