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嗜水气单胞菌临床分离株主要毒素基因型分析及胞外蛋白免疫蛋白组学研究

倪晓丹

   嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)是重要的水生病原菌,给水产养殖业造成极大的经济损失,同时还是重要的人畜共患病病原菌。该菌致病机制复杂,涉及多种毒力因子,而胞外产物在该菌致病性和免疫原性上都占有重要地位。 为了研究嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)不同分离株毒力因子的分布特征,本试验选取嗜水气单胞菌的5种主要胞外毒力因子-气溶素(Aer)、溶血素(β-hly)、细胞毒性肠毒素(Act)、温敏胞外蛋白酶(eprCAI)、和细胞兴奋性肠毒素(Alt),设计并合成5对引物,对实验室保存的58株嗜水气单胞菌(大多分离自患病水生动物)进行PCR检测,了解嗜水气单胞菌不同分离株毒力基因的分布状况。根据4种胞外毒素的分布情况,可将58株嗜水气单胞菌分离株分为5个毒素基因型:Aer~+β-hly~+Act~+Alt~+占79.3%(46/58);Aer~+β-hly~+Act~+Alt~-占8.6%(5/58);Aer~+β-hly~+Act~-Alt~-占3.4%(2/58);Aer~+β-hly~-Act~-Alt~-占3.4%(2/58);Aer~-β-hly~-Act~-Alt~-占5.2%(3/58)。其中以4种胞外毒素基因扩增均阳性的菌株比例最高。 为了研究嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)不同分离株的溶血性、细胞毒性、致病性与主要毒力基因型分布之间的关系,本试验选取五种毒力基因型的代表菌株进行溶血价、细胞毒性的测定及小鼠和剑尾鱼的致病性试验。结果显示,不同毒力基因型的菌株携带的毒力基因、溶血价与动物致死率之间有明显的相关性。以J-1强毒株为代表株的Aer~+β-hly~+Act~+Alt~+为主要毒素基因型,溶血价1:128,细胞毒力效价为1:256,对小鼠和剑尾鱼的致死率为100%。随毒力基因携带的减少,溶血性下降,细胞毒力下降,菌株对小鼠和剑尾鱼的致死率也下降。 寻找疫苗候选抗原蛋白是嗜水气单胞茵病新型基因工程亚单位疫苗研制的关键。本试验采用免疫蛋白组学的方法,以嗜水气单胞菌J-1株全菌抗血清作为一抗,辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌蛋白A(HRP-SPA)为二抗,将二维电泳凝胶转印到PVDF膜上,从而鉴定J-1株胞外蛋白中具有免疫原性的蛋白。将重复胶上与之对应的蛋白点进行质谱分析。共有10个免疫原性蛋白被鉴定出来,其中包括核酸酶、外膜蛋白、鞭毛蛋白A、弹性蛋白、溶血素、气溶素前体蛋白、金属蛋白酶等。选取外膜蛋白(OMP)和鞭毛蛋白A(FlaA),根据其对应基因序列设计并合成引物,进行PCR检测,调查蛋白基因在菌株中的分布率,结果表明两种蛋白基因的存在较为普遍,分布率分别为74%(37/50)和76%(38/50)。本研究为进一步确定疫苗候选抗原靶分子提供依据。……   
[关键词]:嗜水气单胞菌;胞外毒素;PCR;致病性;免疫蛋白组学;胞外蛋白
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京农业大学2008年