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枯草杆菌α-淀粉酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达

柳辉

   α-淀粉酶是一种重要的工业用酶,一般采取筛选高产α-淀粉酶菌株或利用基因工程技术构建α-淀粉酶分泌型工程菌规模生产,以满足工业生产的需求。本文利用低温显色法和摇瓶发酵法,从样品中筛选出一株产α-淀粉酶菌株XL-15,初测酶活力达到30.0U/mL。通过菌落形态、菌体特征观察以及16S rDNA序列比对鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis XL-15)。发酵粗酶液经硫酸铵初步沉淀、透析脱盐后,对其基本酶学性质进行了初步分析。结果表明所产α-淀粉酶最适反应pH和温度分别为6.5和50℃,Ca~(2+)、Mn~(2+)对该酶有激活作用,而Cu~(2+)、Zn~(2+)和EDTA对其有抑制作用,酶动力学实验测得的米氏常数Km值为1.726mg/mL。 以B. subtilis XL-15基因组DNA为模板,运用PCR方法成功克隆了α-淀粉酶基因。该扩增片断中含α-淀粉酶基因自身信号肽序列,开放式阅读框(ORF)大小为1980bp,编码659个氨基酸残基。将该结构基因分别转入大肠杆菌表达载体pET-28a(+)和毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组表达质粒pET28-Amy和pPIC9K-Amy,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母GS115感受态细胞,并进行诱导培养表达。结果表明:大肠杆菌菌体破碎上清液中未检测出酶活性,SDS-PAGE电泳分析显示表达产物均以无活性的包涵体形式存在;而毕赤酵母在α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,利用甲醇进行诱导,经高密度培养后表达产物分泌至胞外,发酵液酶活力检测为4.3U/mL,实现了B. subtilisα-淀粉酶基因在毕赤酵母中的分泌表达,为α-淀粉酶基因在毕赤酵母中表达做了有益探索。……   
[关键词]:枯草芽孢杆菌XL-15;巴斯德毕赤酵母;α-淀粉酶;基因克隆;分泌表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中科技大学2007年