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真姬菇液态发酵及菌丝体多糖的提取纯化与结构解析

付娟妮

   真姬菇(Hypsizigus marmoreus(Peck)Bigelow)隶属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、离褶菌族、玉蕈属,含有多种活性物质,具有很高的营养和药用价值。 本文以西北农林科技大学食品学院实验室保藏的真姬菇多糖高产菌株ZJ029为研究对象,通过考察34种营养因子对ZJ029菌株液态发酵产多糖量的影响,优化出菌株的最适发酵培养基。在此基础上,在摇瓶及5L发酵罐上研究并优化了发酵液起始pH、液体种子种龄、接种量、发酵温度、相对溶氧量等发酵工艺条件,确定出了发酵周期。在优化的营养与发酵工艺条件下发酵制得真姬菇菌丝体,对菌丝体多糖的提取、分离、纯化等工艺环节的不同技术方法进行了对比研究与分析,确定采用热碱液提取法提取多糖,运用酶解技术对粗提物脱除蛋白,以阴离子交换柱和葡聚糖凝胶柱为载体对分离得到的多糖进行纯化,同时运用纸层析、紫外光谱、红外光谱、HPLC、GC等技术方法对多糖的纯度及结构进行了综合鉴定与分析。试验取得以下主要结果: (1)在真姬菇ZJ029菌株液态培养中,对胞外多糖产量(Y_1^)有显著影响的营养因子依次为麦芽糖(X_2)、MgSO_4(X_4)、葡萄糖(X_1),这3个因子对胞外多糖的影响可用表达式i:Y_1^=1.21+0.093×X_1+0.14×X_2+1.11×X_4来描述。对胞内多糖产量(Y_2^)有显著影响的营养因子依次为玉米淀粉(X_3)、MgSO_4(X_4)、葡萄糖(X_1),这3个因子对胞内多糖的影响可用表达式ii:Y_2^=-0.021+0.017×X_1+0.041>X_3+0.23×X_4来描述。 (2)产多糖量与成本价格比相对较高的4个营养因子即玉米淀粉(X_1)、葡萄糖(X_2)、MgSO_4(X_3)、豆粕粉(X_4)与胞外多糖(Y_3^)的关系模型可用表达式iii:Y_3^=-1.27+0.86X_1+0.29X_2+1.26X_3+0.43X_4-0.025X_1~2-0.003926X_2~2-0.056X_3~2-0.031X_4~2-0.007072X_1X_2-0.093X_1X_3-0.004797X_1X_4-0.003744X_2X_3+0.00016566X_2X_4+0.002656X_3X_4来描述,该模型的校正决定系数达0.8997。与胞内多糖(Y_4^)的关系模型可用表达式iv:Y_4^=-0.1 7+0.13X_1+0.044X_2+0.20X_3+0.047X_4-0.003852X_1~2-0.0005903X_2~2-0.009031X_3~2-0.003582X_4~2-0.001116X_1X_2-0.015X_1X_3-0.003954X_1X_4-0.0008063X_2X_3+0.00007187X_2X_4+0.0016556X_3X_4来描述,该模型试验真实值与预测值之间的相关性高达97%。 (3)优化得出真姬菇ZJ029菌株深层培养的最佳营养条件为:玉米淀粉5.63g/L、葡萄糖25.11g/L、豆粕粉6.84 g/L、MgSO_43.84g/L、KH_2PO_4 3g/L、KNO_31g/L、V_(B1)10mg/L。发酵罐发酵生产的最佳工艺条件为:发酵液自然初始pH值(约为6.5)、液体种子种龄6d、接种量10%、发酵温度25℃、发酵罐相对溶氧量80%、发酵周期8d,在此营养及工艺条件下发酵,每升可获得1.98g胞内多糖和9.45g胞外多糖。 (4)真姬菇菌丝体多糖的碱提取工艺中3个关键参数即提取温度(X_1)、提取时间(X_2)、液料比(X_3)与多糖提取率(Y^)之间的关系更接近于二次多项式模型v:Y^=-339.43+6.68X_1+16.45X_2+2.56X_3-0.035X_1~2+1.66X_2~2-0.055X_3~2-0.23X_1X_2+0.007X_1X_3-0.25X_2X_3,模型的预测值与试验真实值之间的相关性达95.26%,模型能够解释84%的总变异。当提取温度在83℃~88℃、提取时间在3.4h~3.8h、料液比在1:21 g/mL~1:24 g/mL范围时,多糖得率不低于5.8%。获得最大多糖得率的工艺条件为提取温度83.95℃、提取时间3.80h、料液比1:21g/mL、提取液pH13、醇沉时乙醇用量为提取液体积的3倍,在此条件下,真姬菇菌丝体多糖碱液提取法的多糖得率为7.97%。 (5)Sevag法脱除真姬菇菌丝体多糖中蛋白质的条件是:震荡时间30min、样品:Sevag=2:1、脱除次数1次,在此条件下,蛋白质脱除率为33.8%,多糖损失率为25.1%。与木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶相比较,碱性蛋白酶更适合用来脱除真姬菇菌丝体多糖中的蛋白质。碱性蛋白酶酶解法脱蛋白的适宜条件为:酶解温度50℃、加酶量2.687 u/mg、酶解时间3.5h,此时蛋白质脱除率为63.4%,多糖损失率为8.3%。在碱提真姬菇菌丝体多糖脱蛋白过程中,碱性蛋白酶酶解法比Sevag法更有效。 (6)真姬菇菌丝体脱蛋白多糖经DEAE-Sephadex A-25柱层析后获得2种不同极性大小的多糖组分:A-25-1、A-25-3。采用纸色谱鉴定纯度表明,这2种多糖为均一组分,紫外光谱表明它们不含蛋白质和核酸;而Sephadex G-200柱层析和HPLC色谱鉴定结果表明这2种组分均不是均一多糖;进一步用Sephadex G-200层析柱对A-25-1、A-25-3组分进行纯化,可以获得TⅠ-1、TⅠ-2、TⅡ-1、TⅡ-2、TⅢ-1、TⅢ-2、NⅣ7种多糖组分,经HPLC色谱鉴定纯度,表明其中3种组分TⅡ-2、TⅢ-2、NⅣ为均一多糖,满足化学定性定量分析标准。 (7)化学分析法结合紫外光谱、红外光谱、HPLC、GC对真姬菇菌丝体纯化多糖的部分物化性质和结构研究表明,组分TⅢ-2由岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖4种单糖组成,其摩尔比为1.00:3.39:0.63:1.28,分子量为19136Da;该多糖主链是由β-D-半乳糖以1→3糖苷键连接而成,支链是由1→3糖苷键连接的D-葡萄糖和少量D-甘露糖组成,另外多糖链中还含有少量1→4、1→6糖苷键。组分NIV是由岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖组成,其摩尔比为1.00:0.59:1.11:2.80:2.25:1.25:0.62,分子量为522981Da;该多糖主链是由α-D-半乳糖和D-葡萄糖以1→3糖苷键连接的二糖重复单元组成,支链主要由1→4糖苷键键合的阿拉伯糖组成,另外糖链中还含有部分1→6糖苷键。 本论文的创新点在于: (1)首次对真姬菇发酵菌丝体多糖的提取、分离、纯化技术作了系统研究,并获得了分子量分别为19136Da、522981Da的2种纯化多糖即TⅢ-2、NⅣ,明确了TⅢ-2、NⅣ的单糖组成及配比,同时对该多糖的结构进行了分析探讨。该多糖与报道的真姬菇子实体多糖的组成和结构不同,为首次获得。 (2)关于真姬菇的液态培养研究,以往的报道均以菌丝体生物量为衡量指标,摇瓶培养研究10多种营养因子对菌株生长的影响。而本文则以胞内、胞外多糖产量为指标,采用发酵罐发酵研究了34种营养因子对菌株生长的影响,并优化出了发酵工艺条件。……   
[关键词]:真姬菇;液体培养;多糖;分离;纯化;结构表征
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2008年