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青蒿分子标记体系的初步研究

邓婧

   中药青蒿来源于菊科植物青蒿(Artemisia annua.L)干燥的地上部分,其有效成分青蒿素为抗疟特效药。青蒿素的生产主要依靠从青蒿植株中提取,而青蒿素在青蒿植株中含量很低,且易受外界条件影响,青蒿不同基因型,不同个体之间青蒿素的含量差异很大,这些遗传差异导致青蒿各个植株间青蒿素的含量差异,因此,对青蒿进行品种品质评、遗传育种价等方面的研究日益重要。 分子标记作为遗传育种,品种鉴定,品质评价等研究的重要手段,具有较高的多态性,遍布整个基因组,重复性好等特点。其中,ISSR标记多态性来源于SSR间的序列变异,其重复性较好;SRAP标记是对ORF进行扩增,具有简便、稳定、中等产率、在基因组中分布均匀的特点;基于反转录转座子的分子标记,其多态性来源于反转座子的结构、组成、分布和逆转座的生物学过程,在种群间及种群内都有较高的多态性。这几种分子标记在农作物中研究较多,而药用植物研究鲜见报道,本文对青蒿进行了这几种分子标记的初步研究。 ISSR和SRAP标记是基于PCR的标记,其反应条件易受各种因素的干扰,为确保ISSR和SRAP分析结果的可靠性和重复性,本文通过对PCR反应体系中的模板DNA、Taq DNA聚合酶、dNTP以及Mg~(2+)浓度,引物退火温度等的最佳反应条件进行探索,建立了适用于青蒿的优化的ISSR、SRAP反应体系。 建立反转录转座子分子标记,首先应克隆其基因序列。在LTR类反转录转座子中,具有编码负责RNA的成熟和包装蛋白质的gag基因,编码反转录酶的RT基因,编码整合酶的int基因和编码核酸酶的RNaseH,可以根据这些结构基因保守区域设计引物,进行克隆。 本文采用同源克隆法克隆青蒿的反转录转座子基因序列,参照Pearces等人建立的在植物中快速分离反转录转座子的长末端重复序列的方法,根据编码核酸酶的RNaseH基因的两个保守序列设计引物,提取青蒿总DNA后,采用限制性内切酶酶切,接头连接,通过保守序列引物和接头引物进行巢式PCR扩增,回收扩增产物,将目的片段与质粒载体连接,重组载体经电击转化大肠杆菌,用菌落PCR法筛选克隆,检测合格的克隆进行序列测定。测得序列采用在线方式经NCBI的Genbank选择Blastx做序列比对,初步确定该序列为Ty3-gypsy类反转录转座子的部分序列,Genbank序列号为:EF422339。……   
[关键词]:青蒿;ISSR标记;SRAP标记;反应参数优化;反转录转座子;RNaseH基因;巢式PCR;基因克隆
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:成都中医药大学2007年