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鹰嘴豆蛋白酶解物的制备及其抗氧化肽的研究

李艳红

   鹰嘴豆(Cicer arietium L.)为豆科草本植物,主要分布在世界温暖而又比较干旱的地区。20世纪80年代中国从国际干旱地区农业研究中心(ICARDA)和国际半干旱地区农业研究所(ICRISAT)引入了数百份鹰嘴豆栽培种,已在甘肃、新疆、青海、内蒙古等地试种。 鹰嘴豆蛋白含量因品种不同而有较大差异,介于15-30%之间。鹰嘴豆蛋白因其均衡的氨基酸组成、生物利用率高和抗营养因子低而被作为植物蛋白的重要来源,也是获得生物活性肽的很好资源。本文以鹰嘴豆蛋白为对象,采用生物酶解、抗氧化试验、凝胶色谱、反相高效液相色谱、质谱以及超高压等方法,系统研究了酶解工艺的各主要参数、酶解物体外体内抗氧化活性、抗氧化肽的分离纯化和结构表征以及超高压对酶解制备抗氧化肽的影响,为开发鹰嘴豆抗氧化肽功能性产品提供理论基础。主要结果如下: 以鹰嘴豆蛋白为底物,分别用碱性蛋白酶Alcalase、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶nutrase、蛋白酶AS1.398及蛋白酶Protamex在各自适宜的条件下进行酶解,比较酶解物的水解度和超氧阴离子捕获率。结果表明鹰嘴豆蛋白在碱性蛋白酶Alcalase的作用下,其酶解速度相对较快,超氧阴离子捕获率较高;在Alcalase水解鹰嘴豆蛋白单因素试验的基础上,采用响应面设计进行了试验优化,得到最优酶解条件为:[E]/[S]2.72%,温度52°C,时间31min,该条件下制备的鹰嘴豆酶解物的还原能力和超氧阴离子捕获率分别为0.667和61.55%,且测得该酶解物水解度为15.13%。 采用不同体外抗氧化体系,全面研究了不同水解度(DH=5-25%)鹰嘴豆蛋白酶解物的抗氧化能力,结果表明水解度(DH)为15%鹰嘴豆蛋白酶解物具有最高体外抗氧化活性。对不同水解度鹰嘴豆蛋白酶解物的相对分子量分布进行了研究,随着鹰嘴豆蛋白水解度的增大,较大分子量的蛋白不断的被酶解成小分子量的多肽,水解度(DH)为15%的鹰嘴豆蛋白酶解物抗氧化性较强,其相对分子量在300-1,500范围内的肽段含量较高;当鹰嘴豆蛋白酶解物被进一步水解成小分子的氨基酸时,抗氧化性开始减弱。并对鹰嘴豆蛋白酶解物进行了体内抗氧化试验,结果表明高中剂量的鹰嘴豆蛋白酶解物能显著提高D-半乳糖致衰模型中小鼠血清、肝脏和心脏组织中SOD和GSH-Px的活性(p<0.01),而显著降低其体内MDA的含量(p<0.01),结果表明鹰嘴豆蛋白酶解物对小鼠具有很好的抗氧化防衰老作用。 利用Sephadex G-25凝胶色谱将CPH分成四个组分Fra.I-IV,并分别检测了各组分的还原能力、对亚油酸的自氧化的抑制率以及对不同自由基的捕获能力,最后筛出Fra.IV为抗氧化能力最高的组分,其余三组分的抗氧化能力依次为:Fra.I > Fra.III > Fra.II。并对Fra.I-IV进行相对分子量分布分析,发现该肽段的相对分子量主要集中在1286左右(49.21%)和652左右(40.63%)。随后采用半制备RP-HPLC将Fra.IV分成11个组分,以自由基捕获率为指标筛选出具有较强抗氧化活性的组分Fra.IV-7,经RP-HPLC鉴定为单一峰;结合氨基酸组成分析和MALDI-TOF-TOF二级质谱,鉴定出抗氧化活性肽Fra.IV-7的相对分子量为717.37,氨基酸序列为NRYHE (Asn-Arg-Tyr-His-Glu)。其对DPPH、羟自由基和超氧阴离子的捕获率分别为:45.33%、79.81%和60.09%;对Cu2+和Fe2+的螯合能力分别为76.92%和63.08%;放置8天后对亚油酸自氧化的抑制率为88.81%,远高于添加同剂量VE八天后的抑制率(58.85%)。 虽然可以通过酶解工艺的优化获得抗氧活性较高的酶解物,但其得率相对较低,成分复杂多样,鉴于今年来超高压技术作为一种新兴的非热食品加工技术,不仅可以在加工过程中保持食品的原有感官和营养成分尤其是一些热敏性营养因子如维生素等,而且可以提高蛋白质的酶解效率并释放活性肽。因此本研究分别以水解度和抗氧化性为指标,采用两种方式运用超高压技术对鹰嘴豆蛋白酶解处理:其一是在酶解之前采用100-600 MPa超高压预处理鹰嘴豆蛋白,结果表明100和200 MPa超高压预处理对鹰嘴豆蛋白的酶法水解进程曲线无显著影响;300 MPa以上可提高酶解速率,但400-600 MPa反而会较300 MPa的酶解速率稍低。在酶解前300 MPa以上压力预处理鹰嘴豆蛋白可显著提高酶解物对超氧阴离子的捕获率(P<0.05),尤以400 MPa提升最为显著,从对照样品35.15%的捕获率提升到45.54%。而且400 MPa处理后的蛋白质进行酶解时可缩短获得最大抗氧化活性肽的制备时间。其二是使用Alcalase在超高压处理(100-300 MPa)过程中进行酶解,能显著提高鹰嘴豆蛋白质的水解度,当压力为200 MPa 30 min处理时水解度达到最大。且在超高压(100-300 MPa)下酶解较之在常压下(0.1 MPa)酶解所制得的鹰嘴豆蛋白酶解物对超氧阴离子的捕获率都有显著的提高(P<0.01),当压力为200 MPa 20 min处理时其抗氧化活性达到最高:超氧阴离子捕获率为66.26%±1.67;还原能力A700为0.406±0.006。同时对超高压处理(100-300 MPa)过程中酶解不同时间与常压下酶解不同时间所得酶解物进行相对分子量分布测定,发现在压力下酶解较常压下酶解可以显著提高小分子量肽段含量,尤其是相对分子量在500-1000的肽段;从而得出在此条件下超高压可加速具有抗氧活性(相对分子量为500-1000)肽段的累积。……   
[关键词]:鹰嘴豆蛋白酶解物;Alcalase;酶解;抗氧化;结构鉴定;超高压
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:江南大学2008年