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鸡C3d-P29分子佐剂作用效果的研究

褚新星

   基因疫苗主要由真核表达载体和保护性抗原基因构成,此种疫苗与传统疫苗相比,具有设计灵活、安全性高、性质稳定、成本低、同时诱导体液免疫和细胞免疫等优点。然而核酸疫苗存在的问题是产生抗体慢且水平低,需要加入有效的佐剂才能克服这些缺陷。 补体C3是机体补体激活的经典途径、替代途径以及甘露聚糖结合凝集素(MBL)途径的交汇点的中心成分,是宿主防御机能的一个分子。C3d片段是补体C3的裂解片段之一,是C3分子ɑ链不能被蛋白酶再裂解并仍保持与抗原共价连接的最小片段,具有广泛的免疫学功能。其可以直接与抗原递呈细胞(APC)上的CR2受体结合,从而降低淋巴细胞的活化阈,提高抗原分子的免疫原性。因此C3d被认为是基因疫苗的有效的分子佐剂。 新城疫病毒DNA疫苗是以新城疫病毒的F基因和HN基因为主要抗原基因的核酸疫苗。F蛋白即融合蛋白,是NDV一种较大的糖蛋白,是NDV感染细胞所必需的,是构成NDV致病力的重要成分。以F基因为免疫原研制基因疫苗是进行NDV分子免疫学防治的基本策略。 本研究以鸡补体C3d的受体结合功能区P29作为分子佐剂与新城疫病毒的F基因连接,构建了NDV F基因-C3d-p29分子佐剂疫苗,并对其免疫效果进行了初步研究。主要研究内容如下: 试验一、AA肉鸡补体C3d cDNA的克隆 AA肉鸡肝脏经大肠杆菌活化后,液氮研磨法提取肝细胞总RNA。根据GenBank发表序列,利用Primer5软件设计一对引物,RT-PCR扩增C3d基因的cDNA。RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳后克隆到pMD18-T载体,转化大肠杆菌,酶切鉴定后测序,根据测序结果推导氨基酸序列。结果表明AA肉鸡C3d基因与莱杭鸡的同源性为99.5%,证明得到了AA肉鸡C3d基因。比较鸡与其他动物及人的CR2结合区,发现为鸡与哺乳动物的同源性低,不足40%,而哺乳动物之间的同源性近80%。这表明CR2结合区具有种属的特异性。 试验二、新城疫病毒C3d-P29分子佐剂F基因疫苗的构建 C3d是补体C3的裂解产物之一,与抗原相连时可以明显提高抗原分子的免疫原性。CR2/CD21在其功能发挥过程中起到重要作用,P29为编码C3d与CR2结合区域的基因。在克隆出C3d cDNA基础上,设计引物克隆P29至pUC19载体,利用同裂酶BamH I和Bgl II构建pUC-P29.n。酶切获得P29.n,将其克隆至真核表达载体pCDNA3.1(+)。最后RT-PCR扩增新城疫F基因,定向克隆至真核表达载体pCDNA-P29.n中P29.n的上游,构建完成新城疫F基因疫苗。 对3周龄SPF鸡进行基因免疫,结果pCDNA-F-P29.4、pCDNA-F-P29.6较pCDNA-F都能够提高HI抗体水平及保护力,虽然HI抗体水平不及灭活苗,但是能够抵抗致死量病毒的攻击,并且pCDNA-F-P29.6效果更好。……   
[关键词]:鸡C3d;基因疫苗;RT-PCR;CR2结合区;pUC- P29.n
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东农业大学2008年