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新型荧光标记试剂SPA-EGFP融合蛋白的应用研究

宋超

   以荧光标记物为探针的荧光免疫测定法(fluorescence immunoassay,FIA)始创于20世纪40年代初,是一种历史悠久的标记免疫测定法。其原理就是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合,以荧光物质标记抗体,对组织或细胞内的抗原物质进行定位检测。由于FIA的特异性、快速性和在细胞水平定位的准确性,并随着各种新的荧光物质的发现及标记方法的不断改进,FIA在免疫学、微生物学、病理学、肿瘤学以及临床检验等许多方面已得到广泛应用,日益发挥重要的作用。 本研究在实验室前期研究的基础上,对构建好的GS115/pPIC9K/spa-egfp工程菌进行诱导表达。BMMY培养基中甲醇的添加由24小时补充一次改为12小时补充一次,省略原先要添加的组氨酸和1%的Casamino acids,结果显示对表达效果没有明显的影响。表达上清液经HisTrap HP柱两次纯化,收率分析得出两次总收率可达63.3%,平均收率可提高23.2%。获得SPA-EGFP融合蛋白纯度达95%,完全符合荧光免疫检测应用的需要。 本研究利用纯化的SPA-EGFP融合蛋白作为荧光标记试剂,采用间接免疫荧光检测法,以乙肝病毒表面抗体作为检测对象,对SPA-EGFP融合蛋白的检测条件进行研究。结果显示以pH7.2,100mM PBS缓冲液(加0.1%Tween 20)作为洗脱液应用于SPA-EGFP融合蛋白的间接免疫荧光检测时,洗脱效果较理想,是较为适宜的洗脱液。实验结果显示抗原抗体复合物经SPA-EGFP融合蛋白标记,在倒置荧光显微镜的蓝光激发下观察,呈现为明亮的绿色荧光斑,而背景呈较为均一的黑色,可辨程度高。长时间观察时,荧光强度基本不变,无明显淬灭现象。 我们利用上述检测条件对283份体检血清进行乙肝表面抗体(hepatitis Bsurface antibody,HBsAb)的FIA检测,并采用ELISA法进行同步检测。结果显示阳性检出率FIA为72.08%,ELISA为73.85%,两种检测方法具有较高的一致性,其检测结果的一致性高达98.23%。可见利用我们确定的洗脱液配方,SPA-EGFP-FIA对乙肝抗体的检测是切实可行,并且效果良好的。 本研究用SPA-EGFP融合蛋白代替EUROIMMUN抗核抗体检测试剂盒中的FITC标记的羊抗人IgG抗体,通过间接免疫荧光法检测已经确诊的系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)病人血清。研究显示25份血清样品全部显示阳性,SPA-EGFP融合蛋白的荧光模式与FITC是相同的,并且SPA-EGFP融合蛋白具有染色背景淡,荧光稳定,非特异性染色较低等优点。确定的PBS洗脱液洗脱效果能够达到最佳的检测要求。 SPA-EGFP融合蛋白作为一种新型的荧光标记试剂,在荧光免疫检测中的应用必将越来越广泛。随着研究的进一步深入,其可能在免疫芯片和流式细胞技术中得到应用。……   
[关键词]:荧光免疫测定法;绿色荧光蛋白;葡萄球菌蛋白A;融合蛋白;乙肝病毒表面抗体;抗核抗体
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东大学2008年