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喹诺酮药物族特异性识别材料及其检测性能的研究

曹立民

   食品中农兽药多残留的快速筛选检测,是当前及今后一段时期内食品安全检测领域的研究难点和热点之一。本论文针对目前应用较广泛的喹诺酮类药物,研究了DNA以及抗体两种生物材料对其的亲和识别特征,建立了相关的模拟和预测体系,完成了族特异性识别材料的筛选制备;在此基础上建立了食品中喹诺酮多残留的快速筛选技术,对所制备识别材料的应用性能进行了验证和完善。主要研究结果归纳如下: (1)首次采用平衡透析方式研究确定了DNA对于喹诺酮类药物的特异性结合作用、关键参数及主要影响因素。研究表明pH以及Mg~(2+)对于DNA-喹诺酮之间的结合具有显著影响,最适pH处于6—7之间,最适Mg~(2+)浓度为0.5-1.0mM;单链DNA对于恩诺沙星的亲和常数以及结合比约为双链DNA的2倍,而且与恩诺沙星等6种喹诺酮呈现出非常相似的结合性能:亲和常数都处于0.94×10~5 M~(-1)至2.40×10~5 M~(-1)之间,而结合比在4.1—6.9之间,显示出较为明显的族特异性识别特征;以未经纯化处理的牛奶为食品样本进行了DNA-恩诺沙星结合能力的验证实验,与缓冲液中的结果没有显著差异,证明所采用的DNA对于喹诺酮具有较高的特异性,可以作为族特异性识别材料用于食品分析等。 (2)以单链DNA为喹诺酮识别材料,发展了表面等离子共振生物(SPR)传感器,并以牛奶为样本对其检测性能进行了验证。研究中利用LbL多层累积手段,以PDDA为配体多聚阳离子建立了DNA-PDDA在传感器芯片表面的共固定化技术,固定化DNA数量与LbL循环反应次数之间存在显著的正相关性;适量Mg~(2+)的添加以及牛奶提取液对芯片的预处理,可以有效消除非特异性结合等因素对于检测的干扰;在加标牛奶样本中进行的检测显示出较好的特异性,对于思诺沙星的检测限约为3μg mL~(-1),批内变异系数<15%,0—120μg mL~(-1)之间呈现较好的线性关系。 (3)利用Cerius2软件等建立了分子模拟及预测模型,并在此基础上完成了具有较高族结构特征的喹诺酮半抗原的筛选。对喹诺酮分子的空间构象进行模拟和叠合的结果表明,1位取代基和7位是导致不同药物间构象差异的主要因素,1位与邻近位置间的相互作用会对分子的整体构象产生影响;首次建立了分子空间结构相似度的计算与预测模型,拟合验证表明,结构相似度与抗体交叉反应率之间存在较显著的线性相关性(R=0.7852,P<0.0001),证明该定量模拟模型具有较高的准确度;分子模拟结果表明,培氟沙星、恩诺沙星以及环丙沙星甲基化修饰物具有较高的族内结构相似度。 (4)分别制备了培氟沙星和环丙沙星甲基化衍生物抗体,测定表明它们均具有较好的族内识别能力,与前期的分子模拟及预测结果能够较好吻合,其中培氟沙星抗体对所选用10种喹诺酮药物中的9种具有25%以上的交叉反应率,对其中6种的交叉反应率基本达到70%以上。 (5)利用培氟沙星抗体为族特异性识别材料,分别建立了ELISA及DIGFA免疫检测方法,鳗鱼加标检测的结果表明,两种方法均能够对恩诺沙星等6种以上的喹诺酮残留实现有效测定,其中ELISA方法对于10μg kg~(-1)和20μg kg~(-1)加标样本的平均回收率基本达到75%以上,相对标准偏差基本处于15%以内;DIGFA检测的检测限为20μg kg~(-1)以下,检测时间可缩短到半小时以内,检测结果可以肉眼读取而不依赖任何仪器,显示出较突出的简便性、快速性和现场适用性。……   
[关键词]:喹诺酮;族特异性识别材料;多残留;筛选检测
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国海洋大学2008年