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山羊痘病毒表达载体的构建

李有文

   羊痘(Capripoxvirus disease)是由羊痘病毒(Capripoxvirus,CPV)感染山羊、绵羊或牛等偶蹄动物引起的一种烈性传染病,病畜以发热、全身起痘为典型特征。本病世界范围分布,是目前最严重的动物痘病毒病。羊痘病毒基因组较大,有表达多个外来基因的潜力,自然条件下只感染牛羊等反刍类动物,而对人和其它哺乳动物无传染性,是牛、羊等重大传染病重组活疫苗的理想载体。我国目前使用的山羊痘鸡胚化弱毒疫苗的实践证明有很好的免疫保护效果,以此构建山羊痘活疫苗载体具有良好的前景。 本研究的目的是以我国广泛使用的山羊痘弱毒(GTPV)疫苗株G14-STV44-55为模板,通过基因重组等方法构建新型的山羊痘病毒表达载体。本研究选择CPV的三个可能的复制非必需区,以VV I1L或VV P11为调控外源基因的启动子,以GPT为报告基因,构建CPV转移载体,并与亲本病毒G14-STV44-55株重组,筛选重组的GTPV突变株。 将用于重组病毒筛选的VV 7.5K启动子调控的gpt基因从PLSEG质粒上切下,并克隆测序鉴定其正确后作为报告基因,选用两种痘苗病毒启动子VV I1L和VV P11,用OVERLAPE PCR的方法与报告基因GPT上7.5K启动子方向相背的连接起来,形成启动子GPT复合DNA片段,构成表达载体的调控和指示系统,再克隆到PGM-T载体中测序鉴定其正确性。 复制非必需区的筛选和克隆是构建重组病毒的先决条件。本研究查阅相关文献,从中选取CPV可能的三个复制非必需区:胸苷激酶(the thymidine kinase,TK)基因,γ干扰素受体(interferon-γreceptor,γ-IFNR)基因和核糖核酸还原酶(the ribonucleotide reductase,RR)基因。根据基因BANK公布的羊痘病毒基因组序列设计引物,使非必需区两侧各有800-1000bp侧翼序列。以我国GTPV疫苗株G14-STV44-55为模板PCR扩增目的基因及其侧翼序列,并克隆到PGM-T载体中测序,然后将已经构建的启动子一报告基因复合DNA片段分别插入非必需区的Acc65Ⅰ,PmeⅠ阳BglⅡ中,得到6个分别以TK基因,IFNR基因和RRASE基因为侧翼、以痘苗病毒VV I1L和VV P11为调控外源基因的启动子、以VV7.5K启动子调控的GPT为报告基因的表达载体:PGM-TK-I1L-GPT,PGM-TK-P11-GPT,PGM-IFNR-P11-GPT,PGM-IFNR-I1L-GPT,PGM-RR-I1L-GPT,PGM-RR-P11-GPT。 采取3-5月龄的临床健康的绵羊睾丸,用胰酶消化法培养睾丸原代细胞。将构建的六种转移载体分别利用脂质体Liposome2000转染GTPV疫苗株G14-STV44-55感染的绵羊睾丸细胞,37℃5%CO_2培养至出现CPE,收获病毒,并以霉酚酸,氨基喋呤为抗性筛选试剂,挑选出筛选液中培养的病变细胞进一步鉴定。将筛选得到的病毒提取基因组做PCR鉴定,并对阳性重组病毒连续用筛选培养液传代纯化,并进行遗传稳定性评价。结果插入γ-IFNR基因的转移载体与亲本病毒发生了重组,得到了两株重组病毒,也说明γ-IFNR基因是山羊痘病毒的非必需区。 本研究在国内首次构建山羊痘病毒表达载体,获得重组病毒突变株,为山羊痘病毒基因重组的二价疫苗或多价疫苗的研制的奠定基础。……   
[关键词]:山羊痘病毒;非必需区;启动子;报告基因;表达载体
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:石河子大学2007年