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食管癌细胞系Eca-109放射前后的差异蛋白质组学研究

庞得全

   目的 应用MTT法和流式细胞仪探讨食管癌细胞系Eca-109的放射生物学特点。应用蛋白质组学方法,分析Eca-109细胞X线照射前后的蛋白质表达差异,以进一步研究食管癌放射治疗的机制,寻找辐射杀伤肿瘤细胞新的分子靶点及如何增加辐射敏感性的分子机制,为肿瘤放射治疗临床应用研究奠定理论基础。 方法 第一部分:应用MTT法绘制食管癌细胞系Eca-109不同剂量照射的细胞生长曲线。应用流式细胞仪检测不同剂量照射的Eca-109的细胞周期变化及凋亡情况,对其进行放射生物学研究。 第二部分:实验主要利用双向电泳,对Eca-109细胞4Gy-X线照射前后的细胞进行蛋白分离。双向凝胶电泳的第一向电泳采用固相pH梯度电泳,第二向采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。电泳后经考马斯亮蓝染色,PDQuest双向凝胶电泳软件分析,并结合人工比对筛选X线照射前后凝胶中相对含量的比值大于2的差异蛋白点,将有意义的差异蛋白质点胶内胰蛋白酶解,为后续质谱分析奠定基础。 第三部分:实验对双向电泳分离出的、凝胶图像PDQuest软件分析并结合人工比对选定的21个差异蛋白斑点,通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-TOF-MS)技术进行蛋白质鉴定分析。对得到的肽质量指纹图谱和部分肽段氨基酸序列结合其等电点、分子量、物种来源、修饰情况等参数在Mascot蛋白数据库中检索,进行蛋白的鉴定。生物信息学分析应用互联网上基因本体论(Gene Ontology)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信息资源,结合人工检索文献数据库,对蛋白质的功能进行深入分析。 结果 1.Eca-109细胞的放射生物学特点:2、4、6、8Gy4组细胞生长抑制率分别为32.81%、35.65%、49.48%、87.13%,剂量越大细胞生长抑制越明显。X射线照射可引起Eca-109细胞的细胞周期变化,表现为随照射剂量增大S期细胞比例降低,而G_2/M期细胞比例增多,G_1期细胞比例变化不明现。Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡情况,0、2、4、6、8Gy组的凋亡率分别为0.53%、0.73%、0.77%、0.88%、1.26%。虽然随着剂量增加凋亡率随之升高,但Eca-109细胞在8Gy剂量内,各组细胞凋亡比例均较小。 2.成功获得Eca109细胞的4Gy-X线照射前后的双向电泳图,经PDQuest软件分析扫描后的图像,4Gy-X线照射组中检测到蛋白点388个,未照射组蛋白点339个,匹配率为87.37%。结合人工比对两组间表达差异的点主要分布于pI4.7-8.9之间,相对分子质量(Mr)在13-100kD区域。两组凝胶匹配点相对含量的比值大于2或小于0.5者认为存在差异,选择符合此条件的差异点21个,在照射组中有16个蛋白高表达,其中11个蛋白在未照射组中表达缺失,5个蛋白表达在2倍以上;未照射组中有5个高表达,其中2个蛋白在照射组中表达缺失,3个蛋白表达在2倍以上。 3.利用MALDI-TOF/TOF-MS串联飞行时间质谱仪结合数据库检索对上述21个差异蛋白点进行鉴定,MASCOT软件搜索Swiss-Prot数据库,得到符合条件的Eca-109细胞4Gy-X线照射前后的差异表达蛋白14个。运用蛋白数据库和文献数据库检索,对上述14种蛋白进行相关信息的汇总分析,分别为细胞角蛋白-18、Y14蛋白、hnRNP C、hnRNP A2/B1、HSP70、HSP60、钙网织蛋白、蛋白质二硫键异构酶A3、Actin-3、Cofilin-1、Lamin-A/C、Actin-related protein 3和鸟氨酸氨基转移酶。除Cofilin-1和角蛋白-18在照射组低表达,其余蛋白均在照射组高表达。对上述14种蛋白质进行GO分析、Swiss-Prot数据库和查阅相关文献分析,结果大多数的蛋白在分子功能注解中表现为结合活性,在生物学功能方面主要与凋亡调节、细胞周期调控、RNA转录、信号转导、细胞骨架组成和辐射应激反应等有关。与KEGG中的生物通路相比较,多数蛋白质通过与通路中某些分子的相互作用而间接参与其中。 结论 1.Eca-109细胞的放射生物学特点:细胞生长抑制与X射线照射剂量呈正相关。X射线照射引起细胞周期变化,主要表现为随照射剂量增大S期细胞比例降低,而G_2/M期细胞比例增多。X射线照射在8Gy剂量以内,各组细胞凋亡比例均较小,提示通过干预提高细胞凋亡率可能提高该细胞的放射敏感性。 2.根据蛋白质不同的分子量和等电点,通过双向凝胶电泳技术可很好的进行蛋白质成分分离,并利用分析软件获得Eca-109细胞4Gy-X线照射前后的差异蛋白质。 3.质谱鉴定和生物信息学分析,发现大多数的蛋白为分子伴侣和细胞骨架成分,在分子功能中表现为结合活性,在生物学功能方面主要与凋亡调节、细胞周期调控、RNA转录、信号转导、细胞骨架组成和辐射应激反应等有关。而这些蛋白可能成为放射治疗及其综合治疗的潜在靶点,从而增加肿瘤的放射敏感性,值得进一步研究,为肿瘤放射治疗研究提出了新的研究思路和方法。……   
[关键词]:食管癌;蛋白质组学;双向凝胶电泳;基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱;基因本体论
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:天津医科大学2008年