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沙田柚花柱自交不亲和相关基因的克隆与鉴定

阳晶

   本研究以高度自交不亲和的沙田柚(Citrus grandis var. Shatinyu Hort.)为试材,采用抑制性消减杂交技术,分别以沙田柚自交花柱cDNA为检测子,异交花柱cDNA为驱动子,构建了自交花柱正向消减cDNA文库,在沙田柚中克隆了与自交不亲和相关基因的EST。并运用菌液PCR技术、重组质粒提取和酶切相结合的方法对文库进行了筛选,从中随机挑取了部分阳性克隆进行测序。所测序列用NCBI-Blastx和Blastn在线软件分析,通过与Genbank中的序列数据库进行同源性比较,我们找到了一些与沙田柚自交不亲和相关的基因,为进一步阐明沙田柚自交不亲和的分子机理奠定了基础。 研究结果如下: 蓝白斑筛选实验表明,SSH文库重组率高于95%,共有247个独立克隆;PCR检测和重组质粒酶切结果表明,文库共获得128个阳性克隆,其插入片段的大小分布在0.1-1.0kb之间,主要集中在250-500bp之间;随机挑取的120个阳性克隆的测序结果显示,共获得30条独立的ESTs,其中23条具有明确的功能比对结果,占总数的76.7%。 23条ESTs,通过Blastx搜索,找到两类与自交不亲和相关的基因:hect E3泛素连接酶和蛋白激酶表达基因,前者可能通过泛素/26S蛋白酶体途径介导沙田柚自交不亲和反应,后者可能通过蛋白质磷酸化与去磷酸化的细胞信号识别与转导途径介导沙田柚自交不亲和反应;还找到柱头表达蛋白、质膜H+ ATPase、rRNA内含子编码核酸内切酶以及膜关联蛋白表达基因,这些基因有可能为“膜受体”假说提供分子水平上的证据。 另7条ESTs,通过Blastn搜索,发现其中两条与已报道的自交不亲和相关基因在核酸水平上有较高的同源性,即编码S1-RNase、S9-RNase的基因,相似度分别达到了88%和89%,这2条ESTs极有可能是决定沙田柚自交不亲和的S-基因。还有两条与泛素/26S蛋白酶体途经相关的基因和一些与自交不亲和信号转导相关的基因,以及与细胞凋亡、通道运输和分子伴侣相关的基因,它们可能直接或间接参与沙田柚的自交不亲和反应。 为研究所获得的差异表达基因具有的生物学功能,我们把由Blastx搜索到的蛋白质信息按GO分类系统聚成了9类,根据所占比例的大小顺序排列如下:催化活性、结合类功能、生理学途径、细胞膜成分、分子伴侣、转录调控、调节酶活性、离子运输以及细胞凋亡。这些信息表明沙田柚自交不亲和反应可能是一个复杂的多基因协同作用过程。 此外,还发现抗冻蛋白、柑橘腐根病病毒抗性、动力蛋白重链家族蛋白等与植物逆境胁迫和抗病性功能相关或在核酸水平上有较高同源性的基因。 这些研究为下步克隆相关基因和阐明沙田柚自交不亲和机理的研究打下了良好基础。……   
[关键词]:沙田柚;自交不亲和;抑制性消减杂交;花柱;cDNA文库
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:广西师范大学2008年