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中华卤虫滞育卵发育和重金属刺激相关蛋白质组学研究

周茜

   卤虫(Artemia)是一种广温、耐高盐的小型甲壳动物,广泛分布于内陆盐湖和沿海盐田中。卤虫的无节幼体作为重要的蛋白优质饵料,被广泛的应用于水产养殖生产。卤虫具有特殊的生物学特性,是研究甲壳动物胚胎发育的良好的实验材料,同时也是一种研究动物抗逆机制的模式动物。卤虫有卵生和卵胎生两种繁殖后代的方式,当环境条件适宜时,卤虫倾向于采取卵胎生方式,即直接产生无节幼体;而在恶劣的环境条件下,卵生方式占主要地位,产生处于滞育状态的、具有复杂外壳的休眠卵。卤虫的滞育卵具有独特的生物学特性和特殊的生理生化特点。其发育停滞,细胞分裂停止,酶活力下降,代谢活动受到抑制并可耐受各种极端恶劣环境,如缺氧、低温、紫外线、干燥等。即使在最适的环境中滞育卵的孵化率也很低,只有受到某些特定的非生物信号的刺激才自能终止这种滞育状态,恢复生理代谢;当环境条件适宜时,能够继续发育孵化成无节幼体。因此,卤虫的滞育卵在卤虫的整个生活史中占有重要的地位。另一方面,卤虫是极端环境生物,能够抵抗各种恶劣环境胁迫刺激,因此是研究抗逆机理的良好的实验动物。 本论文利用蛋白质组学技术,研究了卤虫滞育卵及滞育卵发育过程中的蛋白质组表达情况,并研究了卤虫幼体在重金属刺激后蛋白表达的变化情况。得到如下结果: 建立了中华卤虫滞育卵可溶性总蛋白的双向凝胶电泳对照图谱。在pH 4–7、分子量10-100 kDa范围内,检测到约233个蛋白点,并利用高效液相色谱-质谱联用(LC-ESI-MS/MS)技术鉴定了其中的48个丰度较大及感兴趣的蛋白点,根据这些蛋白的生物学功能进行分类,功能类别包括细胞防御蛋白、抗氧化蛋白、细胞骨架蛋白、代谢相关蛋白等。在卤虫滞育卵中共分离鉴定到6个分子量和等电点存在差异的小热休克蛋白p26的异构体,生物信息学分析表明该蛋白有三种不同的功能位点,分别是蛋白激酶C磷酸化位点,Casein激酶II磷酸化位点及N-myristoylation位点。 采用低温脱水的方法对滞育卵进行激活刺激,并对活化卵和滞育卵蛋白表达图谱进行了对比分析。结果表明对卤虫滞育卵的激活刺激引起了其蛋白表达的明显变化。活化卵图谱中蛋白点总数比滞育卵中明显增多,特别是在pI<5.5范围内。约70个蛋白点在激活刺激后上调表达,包括部分只在激活卵中表达的蛋白;25个下调表达,包括部分只在滞育卵中表达的蛋白;其余约60%(占滞育卵蛋白点数目百分比)的蛋白点表达量基本恒定。热休克蛋白家族、抗氧化蛋白家族成员等蛋白变化明显,小热休克蛋白p26、小热休克蛋白ArHsp21蛋白以及过氧化物还原酶异构体在激活卵中特异表达。 活化卵孵化过程中不同发育时期的蛋白表达又呈现出不同的特点,分别在孵化后6h、12h、18h和24h的蛋白质组学图谱上检测到267、285、195和210个蛋白点。孵化后6h和12h休眠卵蛋白表达个数相对较多,与胚胎发育过程中的器官发生和剧烈的形态变化相适应;孵化后18h和24h休眠卵蛋白表达明显下降,部分蛋白的表达关闭,部分蛋白开始富集表达。 利用双向凝胶电泳技术分析了中华卤虫幼体受到急性硫酸铜刺激后的蛋白表达变化情况。通过图谱对比分析,检测到了5mM硫酸铜刺激24h后,卤虫幼体中14个差异表达的蛋白点。利用LC-ESI-MS/MS技术鉴定了其中的7个蛋白,其中3个蛋白上调表达,分别是热休克蛋白70(7.5倍),肌动蛋白(2.3倍)和伴侣分子亚基1(3.0倍)。3个蛋白下调表达,分别是:精氨酸激酶(2.8倍),延伸因子2 (2.0倍)和富含甘氨酸蛋白(2.0倍)。硫酸铜刺激后特异表达的一个蛋白被鉴定为过氧化物还原酶(Peroxiredoxin,Prx)。根据质谱检测提供的蛋白肽段信息和其他生物过氧化物还原酶保守氨基酸序列设计简并引物,结合RACE技术,从中华卤虫幼体中克隆到了过氧化物还原酶基因,该基因的cDNA全长为756个碱基,其中开放阅读框为594个碱基,编码198个氨基酸,其蛋白理论分子量为22.0 kDa,理论等电点为6.98。多序列比对结果显示中华卤虫Prx基因的推导氨基酸序列与美国卤虫和中国对虾的同源性高达98%和94%。实时荧光定量PCR结果显示,硫酸铜刺激后,该基因在卤虫无节幼体中的转录水平明显升高,在24h达到正常水平的3.0倍。……   
[关键词]:中华卤虫;滞育卵;激活卵;胚胎发育;硫酸铜;过氧化物还原酶;蛋白质组学;双向电泳;质谱鉴定
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国科学院研究生院(海洋研究所)2008年