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黄连温胆汤对内质网应激下巨噬细胞凋亡的影响

陈晓瑜

   目的 动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种严重危害人类健康的常见血管疾病,是其他多种心脑血管疾病的病理基础。 巨噬细胞凋亡贯穿于动脉粥样硬化的整个过程,凋亡的巨噬细胞形成动脉硬化斑块的坏死核心,该坏死区域与动脉硬化斑块的不稳定,心肌梗塞,中风和外周血管病的发生有密切关系。 进一步探讨巨噬细胞的凋亡机制,有利于形成处理病变进展的新策略。 中医药具有治疗心脑血管疾病的丰富经验,痰热内阻临床冠心病患者的常见证型。 黄连温胆汤是具有清痰热、畅气机、宁心神的作用。已有的研究显示,该方在临床上对冠心病疗效显著。 本研究采取体外培养巨噬细胞的方法,人工诱导其内质网压力途径的凋亡过程,并观察黄连温胆汤含药血清对其凋亡过程的影响。 方法 1、小鼠巨噬细胞(RAW264.7)的培养 RAW264.7细胞在25cm~2的培养瓶内,以含10%胎牛血清、4.5g/L葡萄糖、IOOU/ml双抗的RPIM-1640培养液,在含有5%体积分数的CO_2培养箱内,保持恒温37℃培养3-5天。细胞长成单层,铺满瓶底的70%左右时即可以0.25%胰酶-EDTA消化传代。 2、小鼠巨噬细胞(RAW264.7)凋亡模型的诱导 取对数生长期的RAW264.7以1×10~5/ml浓度接种于24孔板,每孔1000μl,待长成单层后,加入Tg与Fuc作为凋亡诱导剂的为模型组,不做处理的为空白对照组,每组设3个复孔。放置37℃、5%CO_2的培养箱内培养24h;结束时24孔板内的细胞用胰蛋白酶-EDTA消化,PBS洗后,按Annexin/PI试剂盒的说明书处理细胞后,流式细胞仪检测凋亡率,结果以凋亡百分率表示。 3、黄连温胆汤含药血清与对照血清的制备 黄连温胆汤药物按中药常规煎煮,在恒温箱内浓缩至所需体积。 新西兰兔标号、称重、随机分为空白对照与药物组。 分别以黄连温胆汤和生理盐水灌胃。每天灌胃1次,连续4天,第4天上午灌胃后1小时取血。采取无麻醉下心脏取血。 所取全血分离血清,56℃,30分钟灭活;过滤灭菌并分装;-30℃冰箱保存备用。 4、黄连温胆汤含药血清对正常小鼠巨噬细胞增殖的影响 取对数生长期的RAW264.7按2.5×10~5/mL浓度接种100ul到96孔板中;24h后,细胞贴壁,加入黄连温胆汤含药血清为血清组,加入空白血清为血清对照组;两组分别设立高中低剂量组,另设一组正常普通培养,不加刺激物为空白细胞对照。24h后,加入20ul MTT,继续培养4h;每孔加入150ul的DMSO液置室温下37℃培养箱中15min;待孔底沉淀完全溶解后,用酶标仪在波长570测OD值。 5、黄连温胆汤含药血清对小鼠巨噬细胞凋亡模型的影响 培养后的RAW264.7以1×10~5/ml的浓度接种于24孔板,待长成单层后,加入黄连温胆汤预处理24h后,加入凋亡诱导剂;设立不加任何刺激物者为正常组;只加凋亡诱导剂为模型组,每组设3个复孔。放置37℃、5%CO_2的培养箱内培养。 上述24孔板内的细胞用胰蛋白酶-EDTA消化,PBS洗后,按Annexin V/PI试剂盒的说明书处理细胞后,流式细胞仪检测凋亡率,结果以凋亡百分率表示。 6、黄连温胆汤对凋亡模型细胞清道夫受体表达的影响 培养后的RAW264.7以1×10~5/ml的浓度接种于24孔板,待长成单层后,加入黄连温胆汤预处理24h后,加入凋亡诱导剂;设立不加任何刺激物者为正常组;只加凋亡诱导剂为模型组,每组设3个复孔。放置37℃、5%CO_2的培养箱内培养。 上述24孔板内的细胞用胰蛋白酶-EDTA消化,PBS洗后,按SR-A荧光抗体试剂盒的说明书处理细胞后,流式细胞仪检测凋亡率,结果以荧光强度与荧光百分比表示。 7.统计方法 采用SPSS11.0软件包的方差分析(ANOVA)模块进行数据分析,多组间两两比较采用LSD法。 结果 1.倒置显微镜下观察RAW264.7的生长 在倒置显微镜下观察到RAW264.7为贴壁细胞,呈三角形、椭圆形、多角形等不规则形状,或有突触。 2.以0.5uM Ta+50ug/ml Fuc以及2uM Tg+50ug/ml Fuc刺激RAW264.7细胞48h,均能够稳定诱导出凋亡模型,用SPSS分析,与正常组(空白细胞)数据有显著差异,p<0.05。 3.不同浓度黄连温胆汤含药血清(1:10;1:20;1:40,1:80;1:160)刺激RAW264.7细胞,以MTT法检测细胞增殖情况,1:10浓度的含药血清可以促进细胞增殖,以SPSS分析,与空白细胞及同浓度空白血清组比较,OD值具有显著差别,p<0.05。 4.黄连温胆汤含药血清(1:10终浓度)预刺激RAW264.7细胞,再以凋亡诱导剂诱导凋亡,经检测,预刺激组的凋亡率下降,与凋亡模型及空白血清对照组均有显著差异,p<0.05。 5.与模型组比较时,黄连温胆汤血清不能影响SR-A表达。 结论 以0.5μM Tg联合50μg/ml Puc可诱导小鼠巨噬细胞凋亡,与空白对照组相比,具有统计学意义。 黄连温胆汤含药血清能够明显抑制凋亡模型细胞的凋亡,与模型对照组以及空白血清对照组相比,均有统计学意义。 实验结果表明,抑制巨噬细胞的凋亡可能是黄连温胆汤具有治疗动脉粥样硬化作用的机制之一。 黄连温胆汤含药血清并不具有下调SR-A表达的作用,这一结论说明了黄连温胆汤抑制凋亡的机理可能是作用于p38或JNK这两条途径之一,或两者兼有。 另外,黄连温胆汤含药血清中抑制凋亡的有效成分,可能是对温度变化敏感、易于在反复冻融情况下失效的成分。……   
[关键词]:黄连温胆汤;细胞凋亡;巨噬细胞;动脉粥样硬化;流式细胞仪技术
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:广州中医药大学2008年