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家蚕突变基因的遗传与近等位基因系研究

代方银

   家蚕是重要的经济昆虫,也是遗传学研究良好的实验动物。早期的遗传学和分子生物学研究中,家蚕具有与果蝇几乎相当的地位。家蚕不但具有操作方便、个体大小适中、生长发育周期短、繁殖系数高等优点,而且其遗传资源丰富,是基因突变研究的良好材料。家蚕遗传资源研究一直是蚕学研究的重要领域,并为相关研究领域的发展提供了重要支撑,而今更是家蚕功能基因组研究的重要基础。随着家蚕基础研究的不断深入和拓展,特别是家蚕全基因组计划的完成,推动蚕不仅在蚕丝学领域的研究深入发展,而且使蚕在鳞翅目模式、生物反应器、发育生物学等生物学基础研究和遗传工程等研究中受到前所未有的重视。家蚕模式生物化成为必然的趋势。在此背景下,家蚕新突变、近等位基因系及近交系等创新遗传资源的获得具有十分突出的重要意义,是支撑前述科学研究领域的核心资源。而支撑家蚕遗传资源利用的直接理论基础是蚕的遗传学研究成果。为此,本研究在发展构建世界最大的家蚕遗传资源库的背景下,和建立家蚕功能基因组研究的遗传资源体系的目标中,系统进行了家蚕新突变的发掘、表型研究和遗传分析、基因定位,构建家蚕染色体标记基因的近等位基因系及重要遗传品系的近交系,并应用近等位基因系和近交系进行突变基因的分子定位,初步探索家蚕经典遗传图谱与分子标记图谱的整合,取得的研究结果如下: 1.家蚕新突变基因及重要遗传资源的发掘 通过广泛系统地收集家蚕多样性资源,特别是地方品种资源,结合诱变及野桑蚕与家蚕杂交分离固定,获得家蚕突变体材料,进而通过性状调查、遗传鉴定,发现家蚕新突变等重要遗传资源。本研究获得了丰硕的原始创新结果,发现了29个家蚕新的形态突变基因,研究获得了家蚕广食性遗传系统GS01等,发现了家蚕卵巢管数目变异的11种类型。29个新突变分别是: (1)家蚕卵形、卵色突变8个:新小卵(sm-n)、三眠大卵(Get)、淡红卵(re~p)、新母性白卵(w-1~n)、第3白卵c(w-3~c)、BT924白卵(w-3~(bt))、BH863白卵(w-3~(bh))、新第2褐卵(b-2~n)。 (2)家蚕幼虫斑纹、体色突变7个:微小多星纹(ms~s)、x射线诱发多星纹(mst~x)、楔型眼纹(Wes)、心形眼纹(ces)、第2眼纹全黑(bl-2)、赤起(Rm)、显性黄体色C(Xan~c)。 (3)家蚕幼虫体壁透明性(油蚕)突变4个:第2伴性油蚕(os~2)、h斑油蚕(oh~m)、第2h斑油蚕(oh~(m2))、γ射线诱发油蚕(oc~(co))。 (4)家蚕幼虫体形突变3个:第2数珠蚕(mf-2)、新缢蚕(co-n)、短体蚕(Sq)。 (5)家蚕蛹体色突变2个:浓黑蛹(bp~2)、第2煤色(so~2)。 (6)成虫体色突变2个:从性黑蛾(sml)、黑腹蛾(Ba)。 (7)家蚕茧色新类型2个:绿茧d(Gd)、新绿茧(Gn)。 (8)丝蛋白合成相关突变1个:薄纸茧c(flc-c)。 这些新突变型占国内同期发现总数的90%以上,约占国际同期发现总数的70%以上,丰富了家蚕突变资源,充实和完善了我国家蚕遗传资源库。 2.家蚕新突变的遗传分析 (1)通过精心设计和进行大量的杂交遗传分析,本研究阐明了上述包括广食性系GS01在内的30个遗传突变的基本遗传规律:其中隐性遗传者21个,显性遗传者9个;表现假母性遗传者2个(sm-n、Get),表现母性影响遗传者2个(w-1~n、b-2~n),表现伴性遗传者2个(Get、os~2),表现典型从性遗传者1个(sml);纯合体致死突变2个(Wes和Sq)。 (2)在未进行全面连锁检索的情况下,通过与已知基因间的遗传分析,确定了上述30个新突变中18个的连锁群,其中15个确定了基因座。研究确定了1个新的复等位基因群,并确定其基因的显隐性关系为:+>oh~m>oh~(m2)>oh。 (3)家蚕遗传规律研究具有宝贵的新发现。主要有:本研究发现的从性黑蛾(sml),是家蚕遗传上发现的首个表现典型从性遗传的遗传性状;揭示了家蚕白色卵基因对较深色突变卵色基因(如红色卵等)上位作用的普遍性;研究发现外层黄茧基因(C)对绿色茧(Gn)表现显性上位作用,h斑油蚕(oh~m)对中国油蚕(oc)表现隐性上位作用,发现了家蚕对甘蓝摄食性突变(GS01)的显性抑制基因的客观存在,研究发现了家蚕第4褐卵(b-4)和红色卵(re)间的基因互作关系,双隐性纯合体b-4/b-4 re/re的卵色表现新性状——淡橙黄色卵,等。这些发现丰富了家蚕遗传学内容。 3.家蚕突变系统的基因型鉴定 通过顺反测验,本研究还鉴定了家蚕20余个突变系统的白色卵的基因型或遗传模式、鉴定了20余个突变系统的红色卵的基因型或遗传模式,鉴定了多个突变系统的褐色卵的基因型或遗传模式,等。这些信息的获得,为深入整理家蚕突变基因资源库提供了相关依据,也是这些突变基因系利用的重要依据。 4.突变基因的连锁定位 对新突变基因进行连锁分析,在确定连锁关系的基础上,运用经典的三点测验或两点测验定位突变基因,并将新定位的突变基因补充到家蚕连锁遗传图谱中,这是深入进行突变基因遗传分析的重要内容。本研究完成了5个新突变的连锁定位研究。按照“基因名称(基因符号:连锁群番号-基因位点)”的形式表述,分别是:新缢蚕(co-n:2-5.5)、楔形眼纹(Wes:6-24.3)、无鳞毛翅(nlw:13-28.6)、心形眼纹(ces:14-50.7)、短体蚕(Sq:14-34.6)。 此外,完成了第2数珠蚕(mf-2)的连锁检索,发现其遗传基因属于第15连锁群,表述为:第2数珠蚕(mf-2:15-?)。mf-2的基因座尚待进一步研究。 已将上述5个被定位的基因补充到家蚕连锁遗传图谱中,修订的连锁遗传图谱新增了5个基因位点。 因此,本论文研究共确定了24个新突变的连锁群,确定了20个突变基因的基因座。 5.关于家蚕第27连锁群的修订 对新绿茧(New green cocoon,Gn)的连锁分析发现,Gn与家蚕连锁遗传图谱每个连锁群的标记基因均表现为独立遗传,即Gn不属于现有家蚕连锁遗传图谱的任一连锁群。根据近几年来的研究,家蚕第24、27连锁群应该合并为一个连锁群,即新的第24连锁群。于是,根据本研究,我们将家蚕新绿茧(Gn)作为新的第27连锁群的唯一代表基因,从而使家蚕连锁遗传图谱依然成为一个包括28个连锁群的完整的连锁图谱。这是中国学者在家蚕连锁遗传图谱的研究中首次发现并确定新的连锁群。 6.连锁定位系的构建 进行基因的经典定位分析,需要包含同一连锁群的2个及其以上标记基因的亲本,称为连锁定位系。通过本研究,我们新培育构建了几个重要的连锁定位系统,包括:第2连锁群的co-n-Y、第6连锁群的E~(Kp)-Wes,第13连锁群的b-t-ch-nlw、ch-nlw、b-t-nlw,第14连锁群的oa-ces,第15连锁群的bl-mf-2,第19连锁群的nb-ki-2。这些遗传材料的构建,为定位同一连锁群上的基因以及这些基因与分子连锁图谱的整合研究奠定了资源基础。 含有母性影响遗传基因的连锁定位系的构建,具有特殊的困难,本研究探索建立了一套有效的构建方案,其关键策略在于首先使母性影响遗传基因纯合。这是生物遗传中一个普遍的问题,该方案对其他生物的母性影响遗传基因的连锁遗传和选择具有参考意义。 7.近等位基因系的构建 用大造作受体亲本,构建了家蚕28对染色体各1个重要标记基因的近等位基因系(NearIsogenic Lines,NILs),与轮回亲本的交配次数达到20~25次。采用SSR-PCR技术对所培育的28个近等位基因系和轮回亲本进行遗传检测,结果表明各近等位基因系与轮回亲本之间的遗传相似度达到99.3%~100%。在培育中,对轮回亲本大造同步进行了近交培育,从而保证了育成近等基因系的遗传纯度,通过SSR-PCR对其中的近等位基因系Dazao-K进行遗传检测,结果其群体遗传纯度为99.9%。这些结果表明,这组近等位基因系达到了很高的遗传标准。这是家蚕遗传上首次大规模构建近等位基因系,也是目前世界上最完善的一套家蚕近等位基因系。 8.近交系的培育 采用全同胞交配选择20代以上,培育了家蚕基础研究主要遗传品系大造(Dazao)和C108的近交系,同时培育了本研究发现并建立的广食性系统GS01的近交系,分别命名为:BmIS-Dazao、BmIS-C108、BmIS-GS01。采用SSR-PCR技术对BmIS-Dazao_(20)、BmIS-C108_(20)的个体DNA进行遗传检测,其群体遗传纯度分别为99.17%、99.87%;对BmIS-GS01_(10)的个体DNA进行遗传检测,其群体遗传纯度为88.31%(第20代的遗传纯度检测实验尚在进行)。这些结果说明,经过20代全同胞交配培育的家蚕近交系,其遗传纯度达到哺乳动物关于近交系遗传纯度必须达到99%以上的标准。3个近交系的培育,为家蚕基础研究奠定了标准化实验材料基础,其中广食性近交系BmIS-GS01更适合作为家蚕实验动物品系。该项研究是家蚕全同胞近交系研究的开创性工作。 9.利用近等位基因系和近交系进行突变基因分子定位 (1)用近等位基因系Dazao-Ze、Dazao-L、Dazao-pe、Dazao-ch与近交系BmIS-C108组配杂交组合,进行了家蚕第3、4、5、13染色体的标记基因Ze、L、pe、ch的SSR分子标记定位,获得了此4个标记基因的SSR分子标记连锁图谱,实现了家蚕经典连锁遗传图谱中这4个连锁群与分子连锁图谱的初步整合,并为上述几个连锁群与基因组图谱的对应整合奠定了重要基础。 (2)用近交系与14连锁群的标记基因U、Nd-s、Di、oa组配杂交组合,进行了标记基因的SSR分子标记连锁定位,并通过joinmap作图软件对所获得的连锁图谱进行整合,获得了4个基因的分子标记整合图谱。图谱中4个基因的位置和遗传距离与家蚕经典连锁遗传图谱的14连锁群一致。我们的研究表明,使用标准的遗传材料,可以通过多次实验实现家蚕分子连锁图谱与经典连锁图谱的全面整合。……   
[关键词]:家蚕;突变;遗传分析;基因定位;近等位基因系;近交系;连锁图谱
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:西南大学2008年