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烟草青枯菌拮抗细菌swu31-2的分离及其生物防治效果的研究

张伏军

   青枯病(tobacco bacterial wilt)是一种由布可氏杆菌(Ralstonia solanacearum)引起的细菌性土传病害,是热带,亚热带和一些温暖地区烟草的重要病害。该病在我国长江流域及以南烟区普遍发生,为害严重,个别年份常常暴发流行,造成毁灭性损失。目前,烟草青枯病的防治十分困难,生产上主要采用农业措施和化学防治为主,农业措施防治法受环境和栽培条件的限制,实施起来较困难;而化学防治具有环境污染严重、残留药物对人畜危害大、容易诱导病原菌产生耐药性等问题,逐渐引起严重的社会问题,受到了严重的质疑和挑战。与之相比,生物农药具有无污染、无公害、对人畜毒性低及环境压力小等优点。因此,生物农药的研制与开发具有很大的价值和潜力。 本研究以生物防治烟草青枯病为目的,以具有强致病力的青枯菌为指示菌,从烟草根际土壤中分离得到一株对烟草青枯病有较强拮抗活性的铜绿假单胞菌(Pseudomonas sp.),编号为swu31-2。在此基础上,进行了菌株的鉴定、发酵条件的优化、活性物质的初步分离纯化和部分理化性质研究、菌株在烟草上的定殖能力及对烟草青枯病的盆栽试验等研究工作。主要结果如下: 1.重庆黔江石郎烟区烟草青枯菌生化型和致病力调查 采集具典型青枯病症状的烟株,进行病原菌分离及致病力检测。共分离到36株青枯菌株。根据Hayward划分青枯病菌的标准,对其中的24株病原菌进行生化型的归类。结果表明,其中有5株病原菌属于Ⅲ-1,约占20.83%:另19株烟草青枯菌株属于生化型Ⅲ,约占79.17%。致病力检测结果表明,在36株病原菌中有8株致病力强、13株致病力中等、15株致病力较弱。强致病力病原菌的获得,为后续的拮抗菌筛选和防治研究提供了有利的靶标。 2.拮抗菌株的分离、筛选及鉴定 以筛选到的8株强致病力青枯菌株为靶标,从烟草根际土壤中筛选出具抑制病原菌的拮抗菌swu31-2菌株,对此菌株进行了形态学、生理生化及分子生物学的分类鉴定。研究结果表明,在抑制青枯菌平板实验中,swad1-2菌株的活性物质存在于胞内;连续传代10次后,swu31-2菌株产生的活性物质对病原菌仍然具有较稳定地抑制作用。形态特征、生理生化特性检测发现,SWR31-2菌株为革兰氏阴性杆状细菌,无芽孢,具鞭毛,能运动的好氧菌;在马铃薯固体培养基上培养24h后,菌体生长良好,有明显的绿色色素产生;明胶液化、接触酶反应、氧化酶反应及脓青素反应均呈阳性,4℃不生长,41℃能生长;16S rDNA序列分析显示其序列与铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)AAQW01000001序列、AAQE01000095序列及AAQE01000031序列的16S rDNA同源性均高达99%。综合各项指标鉴定的结果,鉴定该菌株属于假单胞菌属的铜绿假单胞菌,命名为Pseudomonas aeruginosa swu31-2。 3.swu31-2菌株发酵条件的优化 对swu31-2菌株发酵条件作了优化研究,得到培养基的最佳碳源为甘油,氮源为豆饼粉,金属离子为Mg~(2+),磷酸盐为K_2HPO_4以及最适温度为30℃,接种量为3%,初始pH值为8.0,装瓶量为30%,发酵时间为36h。通过正交试验得到最佳发酵培养基各组分:甘油3%,豆饼粉5%,MgSO_4·7H_2O0.3%,K_2HPO_4 0.05%,与King s B发酵培养基相比,利用最佳发酵培养基发酵产生的细菌数从1.49×10~(10)个/mL提高到6.23×10~(10)个/mL,抑菌圈直径从20.7mm提高到28.2mm。 4.swu31-2菌株活性物质初步地分离纯化及其理化性质研究 利用有机溶剂沉淀、离心法去除杂蛋白及硅胶柱初步分离纯化swu31-2菌株的活性物质,并初步探索了拮抗菌株swu31-2活性物质的理化特性。结果表明,活性物质能够较好地耐酸碱、耐高温,对蛋白酶K不敏感;且活性物质能不同程度的溶解于甲醇、乙酸乙酯、丙酮、乙醇和水中,其中在甲醇中溶解性最好;利用氯仿和乙酸乙酯分别萃取水相中的活性物质,检测发现活性物质仍存在于水相中。综合各项结果,初步判断swu31-2菌株的活性物质可能为非蛋白类的小分子物质,为后续的分离和纯化提供一定的理论基础。 5.swu31-2菌株在烟草上的定殖能力及对烟草青枯病的防治作用 首先为获得标记菌株,通过逐步提高链霉素(Streptomycin,Stre)浓度的方法,获得了抗300μg/mL Stre的自发突变菌株,记为swu31-2~*。同时研究结果表明,标记菌株具有稳定的抗药性,且与原始菌株具有同等的平板抑制作用和盆栽防治效果,可以作为swu31-2菌的标记菌株进行定殖研究。 swu31-2~*菌的定殖试验结果表明,swu31-2~*菌株可以很快地定殖到烟草各组织表面及内部,在菌悬液灌根处理1d后,就能在烟草根、茎、叶内部检测到swu31-2~*菌。在8d左右定殖量最大,根、茎、叶分别达到5.57×10~7、6.79×10~6、3.65×10~6 cfu/g,之后有所下降,而对照中无任何菌落长出。这说明swu31-2菌具有内生性特征。同时,定殖20d的检测结果表明,swu31-2~*虽有下降趋势,但仍含有较高的细菌数量,在含量最低的叶内也有1.30×10~5 cfu/g。定殖数量消长动态表明,swu31-2~*菌在烟草根、茎、叶内部均有一个“由升到降”的数量变化趋势;swu31-2~*菌在烟草各组织内部定殖能力强弱为:根>茎>叶。另外,灌根后20d,仍能在烟草根、茎、叶表面检测到标记菌株,说明swu31-2菌能够长时间定殖于烟草各组织表面。 分别利用菌株swu31-2的菌液和活性物质进行烟草青枯病的盆栽防治试验。研究结果表明,swu31-2菌液和活性物质均对烟草青枯病有一定的防治效果。以先施swu31-2菌液和活性物质粗提物的处理较好,防治效果分别为60.87%和60.32%:后施菌液和活性物质粗提物处理的防效分别为39.50%和20.90%。同时研究发现,两种不同防治方法的活性物质处理之间存在着显著性的差异,说明活性物质处理主要起到的是预防作用;而两种不同防治方法的菌液处理之间没有显著性差异,说明菌液处理不仅具有预防作用,而且有较好的治疗效果。……   
[关键词]:拮抗细菌;烟草青枯病;青枯菌;生物防治
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西南大学2008年