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耐辐射球菌deinoxanthin代谢关键酶CrtI和逆境压力保护蛋白Dps-2鉴定与功能研究

许镇坚

   耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans,简称DR)是地球上辐射抗性最强的生物之一,它以对电离辐射和干燥等表现强耐受力而著称。已有研究显示,DR菌极端生存能力是其保护、耐受和修复三方面协同作用的结果,而高效的抗氧化机制和DNA损伤修复是当前研究热点。最新研究认为,电离辐射产生的DNA损伤约80%由辐射水解产生的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)攻击而间接导致,这表明抗氧化损伤保护机制在DR菌中可能扮演重要角色。因此,鉴定和研究DR菌中高效抗氧化物质,对阐明抗氧化保护机制在DR菌中的贡献及解释其极端抗性机制具有重要意义。 类胡萝卜素能高效猝灭单线态氧(~1O_2),并清除多种ROS对生物体造成的伤害。DR菌体内大量合成以deinoxanthin为主要产物的类胡萝卜素,但至今尚缺乏对它们在DR菌中的功能及其代谢的分子机理进行深入的研究。本文主要对deinoxanthin等类胡萝卜素功能及其合成酶CrtI进行鉴定和分析。研究结果如下: 1.以高效液相色谱(HPLC)和薄层层析(TLC)方法分离获得高纯度deinoxanthin色素。化学发光法和体外Fenton反应分析deinoxanthin抗氧化能力,结果表明deinoxanthin具有比lycopene和β-carotene更高效的~1O_2和H_2O_2清除能力,能有效保护质粒DNA并降低其氧化损伤程度。 2.生物信息学方法筛选基因组获得控制deinoxanthin合成的关键蛋白DR0861,蛋白N-端和C-端分别具有保守βαβ折叠Motif和八氢番茄红素脱氢酶(PDS)信号序列。DR0861全基因敲除和N-端功能域(19-69aa)缺失均导致红色DR菌变为无色菌株,HPLC显示DR菌deinoxanthin等类胡萝卜素随DR0861突变而消失,而欧文氏菌(E.uredovora)crtI基因补偿可以使无色突变株恢复颜色。表明DR0861基因参与了DR菌中deinoxanthin的代谢路径,具有催化合成有色类胡萝卜素功能。DR0861缺失影响突变株对γ射线和H_2O_2抗性,导致细胞提取物对~1O_2和H_2O_2清除能力降低。表明DR0861蛋白催化合成的类胡萝卜素参与了DR菌体内的抗氧化保护体系,可能对其极端抗性机制有重要贡献。 3.大肠杆菌(E.coli)过表达和纯化获得DR0861蛋白,体内和体外生化反应产物HPLC分析显示,DR0861能通过多步脱氢反应,催化无色八氢番茄红素(phytoene)底物生成红色的番茄红素(lycopene)产物,表明DR菌DR0861基因编码CrtI类型而非CrtP/Q型PDS。通过对E.coli色素工程菌研究还发现,lycopene等类胡萝卜素的生成可使E.coli产生浅红色,并明显提高E.coli对低剂量电离辐射和H_2O_2抗性。 除研究非酶类抗氧化物(类胡萝卜素)之外,我们还对DR菌抗氧化体系重要组成部分——抗氧化功能蛋白Dps-2进行鉴定和研究。Dps-2(DRB0092)序列含多个赖氨酸保守位点,其N-端前沿包含一段特殊信号肽序列,C-端存在保守亚铁氧化酶(ferroxidase)功能域。dps-2全基因缺失导致DR菌生长受到明显影响,而且细胞对电离辐射、紫外线、干燥和H_2O_2等均表现敏感,并导致蛋白提取物对自由基清除能力降低。E.coli表达和纯化分别获得Dps-2完整蛋白WDps、N-端信号肽突变蛋白N_(30)Dps和C-端ferroxidase突变蛋白C_(20)Dps。SDS-PAGE结果表明,三种蛋白均能形成多聚体,但产生高聚体的比例受盐离子浓度等影响;信号肽突变提高N_(30)Dps对不同温度(37-60℃)的热稳定性,而C-端结构域缺失导致C_(20)Dps蛋白活性对温度异常敏感。Native-PAGE活性染色和亚铁氧化动力学结果表明,WDps和N_(30)Dps蛋白具有催化Fe~(2+)生成Fe~(3+)功能,而C_(20)Dps亚铁氧化酶活性完全丧失。体外DNA结合和Fenton反应结果显示,突变蛋白C_(20)Dps不具有DNA结合功能,不能保护DNA免受自由基攻击;而N_(30)Dps具有结合DNA的能力,它和WDps均能降低Fenton反应自由基攻击导致的DNA氧化损伤。 综上所述,耐辐射球菌DR0861基因编码CrtI类型PDS,它以phytoene为底物,在DR菌体内参与催化合成deinoxanthin。抗氧化保护蛋白Dps-2具有亚铁氧化酶活性和非特异DNA结合等功能,催化毒性Fe~(2+)生成无害Fe~(3+)并能结合生成的Fe~(3+),降低细胞内环境毒性,并与染色体形成致密Dps-DNA复合体,保护DNA降低自由基损伤程度,它与类胡萝卜素等物质共同参与了DR菌体内抗氧化体系,对该菌的极端抗性机制具有重要贡献。……   
[关键词]:耐辐射球菌;抗氧化;类胡萝卜素;deinoxanthin;CrtI;Dps-2
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:浙江大学2008年