手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

抗克百威—三唑磷双特异性单克隆抗体研究

金仁耀

   本论文以杀虫剂克百威和三唑磷为研究对象,合成了一种克百威半抗原4—[[(2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基]氨基]丁酸(BFNB)和两种三唑磷半抗原O-乙基,O-[1-苯基-(H-1,2,4-三唑-3-基),N-(3-羧基-丙基)]硫代磷酸胺(THBu)、O-乙基,O-[1-苯基-(H-1,2,4-三唑-3-基),N-(5-羧基-丙基)]硫代磷酸胺(THHe),然后制备人工抗原,免疫小鼠,通过杂交瘤技术进行细胞融合,获得各自的杂交瘤细胞,并制备了相应的单克隆抗体,腹水效价在10~6以上。在此基础上,采用细胞酶缺陷技术和显微操作技术进行四体杂交瘤细胞的试验研究,获得的单克隆抗体具有双特异性功能和反应性强的特点。 试验对单克隆抗体及其ELISA方法进行了优化:使用Coming公司的COASTAR酶标板、以PBS(0.05M,pH8.0)为抗体包被缓冲溶液、CBS(0.05M,pH9.6)为抗原包被缓冲溶液,37℃包被2h、封闭溶液以2%脱脂牛奶、抗克百威单抗以0.05M PBS缓冲溶液的离子浓度(pH值为7.0)、而抗三唑磷单抗以0.02MPBS(pH值为7.4)为佳。研究建立了克百威和三唑磷直接竞争的ELISA方法(包被抗体模式),结果表明,克百威ELISA方法的检测灵敏度120达到了1.89ng/mL(线性范围为1.11~45.95ng/mE),三唑磷ELISA方法的检测灵敏度120达到了0.15ng/mL(线性范围为0.07~3.90 ng/mL),经过对环境样品、水果和蔬菜等样品进行添加回收率试验,结果表明,除了米和面粉的回收率有所偏高外,其他样品的回收率结果均在75%~130%范围内波动,表明所建立的ELISA方法是可靠的。 对分泌克百威的杂交瘤细胞采用8-氮鸟嘌呤筛选培养,使细胞HGPRT酶缺失,对分泌三唑磷的杂交瘤细胞采用6-氯嘌呤筛选培养,使细胞TK酶缺失,然后进行细胞融合、筛选、检测,获得了一株能分泌抗克百威和三唑磷的双特异性单克隆抗体的四体杂交瘤细胞(12C1-2H12),制备腹水并纯化抗体,通过一系列的反应缓冲体系的筛选和优化,建立了相应ELISA方法。从灵敏度结果比较可知,双特异性单克隆抗体对克百威和三唑磷的检测灵敏度(120)分别为4.46ng/mL和0.36 ng/mL,与单克隆抗体相比略有降低(I_(20)升高)。交叉反应率实验结果表明所制备的双特异性单克隆抗体与克百威和三唑磷相应的结构类似物均无明显交叉反应。结果表明所制备的双特异性单克隆抗体具有很高的双特异性和较高的检测灵敏度。采用双特异性单抗ELISA方法,进行了土壤和水质样品、蔬菜和水果样品中克百威和三唑磷添加回收率试验,水样的检测结果略有偏高,尤其是自来水样;土壤、蔬菜和水果样品的回收率结果均在70~130%范围内,检测结果表明所制备的双特异性单克隆抗体能适用与环境样品、干粉样品,水果和蔬菜样品的检测,所建立的免疫分析方法准确可靠。 通过以上试验研究,本文初步提出了较为系统的基于杂交瘤技术的双特异性单克隆抗体制备技术体系、以及相应的ELISA方法和评价技术,并对双特异性单克隆抗体方法原理进行了初步的研究与探讨。……   
[关键词]:克百威;三唑磷;双特异性单克隆抗体;四体杂交瘤细胞;酶联免疫吸附分析
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:浙江大学2008年