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对虾白斑综合症病毒结构蛋白的鉴定及功能研究

谢希贤

   对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是线形病毒科(Nimaviridae)白斑病毒属(Whispovirus)中一种新型的DNA病毒,是养殖对虾中一种主要的病害。它的宿主范围广,传染力强,致死率高,难防治,不仅严重危害对虾养殖,还对海洋环境构成威胁。本论文对病毒主要膜蛋白和核衣壳蛋白的鉴定及生化属性进行了全面的蛋白质学分析。另外本论文还开展了病毒主要结构蛋白的功能和相互作用的研究。 WSSV病毒粒子从感染病毒的克氏螯虾Procambarus clarkii组织里被提取出来。纯的病毒样品经去污剂Triton X-100处理后分成膜部分和核衣壳部分,随后两部分的蛋白通过12%的聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分离。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)和特异的抗体,主要的膜蛋白和核衣壳蛋白被鉴定。本文中,总共有30种病毒结构蛋白被鉴定,其中22种位于膜部分,7种位于核衣壳部分,另外还有1种蛋白在膜和核衣壳部分都被检测到。利用制备的特异性抗体,8种结构蛋白的定位被进一步研究。另外,蛋白翻译后修饰分析显示所有的结构蛋白都没有糖基化和乙酰化,VP28和VP19存在苏氨酸磷酸化。 病毒wsv311基因的产物VP26是病毒的一个主要结构蛋白。当病毒粒子用Triton X-100处理时,VP26被发现在膜和核衣壳部分都有存在。我们认为VP26可能定位于病毒的膜与核衣壳之间。利用荧光标记方法,我们探索了VP26与宿主细胞蛋白之间的相互作用。通过亲和柱层析,3种能与VP26结合的蛋白从螯虾的血细胞中被纯化出来,其中分子量约42 kDa的蛋白经质谱鉴定为肌动蛋白(Actin)。免疫共沉淀分析证实了VP26与肌动蛋白微丝之间的相互作用。 病毒wsv002基因的产物VP24是病毒的一个主要结构蛋白,早期的研究认为VP24是核衣壳蛋白。本文对VP24在病毒粒子的精确定位进行了研究。当病毒粒子用Triton X-100处理时,VP24被发现只存在于膜部分。Triton X-100的抽提也显示VP24是一个穿膜蛋白。免疫电镜观察进一步证实了VP24定位在病毒的囊膜上。为了探索VP24的功能,纯化的病毒与不同量的VP24抗体的IgG温育后注射螯虾。结果显示VP24抗体的IgG能部分减弱病毒的感染。我们认为VP24是病毒的一个可能在病毒感染早期起作用的膜蛋白。 最后我们探索了病毒膜蛋白之间以及病毒膜蛋白与宿主膜蛋白之间的相互作用。Far-Western实验和免疫共沉淀分析显示VP28能与VP26和VP24相互作用。另外,通过亲和层析,一条分子量约22κDa的能与病毒膜蛋白结合的细胞膜蛋白被纯化,质谱鉴定该蛋白为一个环腺苷酸(cAMP)受体蛋白。总之,本论文获得的数据将为进一步研究病毒侵入及组装的分子机制提供重要的参考。……   
[关键词]:对虾白斑综合症病毒;结构蛋白;相互作用
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:厦门大学2007年