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小苍兰ISSR分子标记

周凌瑜

   小苍兰作为世界十大切花之一,具有很高的观赏价值和经济效益。本文采用简单重复序列间(ISSR,inter-simple sequence repeat)分子标记对现有的12份小苍兰种质进行了研究,分析了其遗传多样性和亲缘关系,为后续的小苍兰育种工作和品种保护提供理论依据。 首先,优化了小苍兰的DNA提取方法。在改良CTAB法的基础上,将研磨粉碎的样品用dd-H2O水洗处理,同时在2XCTAB中加入0.0125mol/L的硼砂去除样品中的酚类物质。在加入酚/氯仿/异戊醇之前,在提取液中加入0.35体积无水乙醇;同时在加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA之前,加入0.5体积5mol/L氯化钠和后续PS Erasol处理去除多糖类物质。DNA中混杂的RNA经RNase水解去除。利用优化的DNA提取方法,对比了从小苍兰不同部位提取的DNA质量,发现幼嫩叶片为最佳的取材部位。利用优化的提取方法,获得了适合ISSR分子标记的高质量小苍兰DNA,为下一步试验提供了材料。 其次,优化了小苍兰ISSR-PCR的反应体系。通过对比研究不同反应体积对PCR结果的影响,我们选择了25μL的反应体系。利用五因素四水平的正交试验,研究了镁离子浓度、dNTPs浓度、模板DNA用量、Taq DNA聚合酶用量和引物用量对ISSR-PCR的影响,建立了适合小苍兰的ISSR-PCR反应体系。在25μL的反应体系中含有1×Taq DNA酶配套缓冲液(10mmol/L Tris·HCl,pH值9.0,50mmol/L KCl,0.1% Triton X-100),2.0mmol/L MgCl2,0.06U/μL Taq DNA聚合酶,4ng/μL模板DNA,0.4μmol/L引物,dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.6mmol/L。同时,通过温度梯度PCR确定了各引物最适宜的退火温度。该优化体系的建立为下一步对小苍兰进行ISSR分子标记奠定了基础。 最后,利用优化的ISSR-PCR反应体系,对12份小苍兰种质进行了ISSR的分子标记研究。数据经NTSYSpc 2.1版分析处理,根据Nei’s遗传距离建立了12份不同花色小苍兰的聚类图和遗传距离图。根据聚类图可以将材料划分为4个类群:白色一组,大红重一组,黄色系和红色系一组,紫色系一组。从分子水平上说明这12份小苍兰种质的遗传背景相对比较简单,遗传基础比较窄。……   
[关键词]:小苍兰;分子标记;ISSR
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:上海交通大学2008年