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红茶菌优势微生物的分离、鉴定及抗菌机理的研究

蒋立文

   红茶菌发酵液是一种由酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等多种微生物发酵而成的一种传统酸性茶饮料。其发酵液中含有多种营养因子,包括茶叶中一些营养成分、活的微生物细胞及其代谢产物。红茶菌来源不同,微生物种类差异很大。本论文对红茶菌优势微生物的分离鉴定、抗菌微生物的筛选、发酵液中蛋白质分析条件优化,培养过程中菌相及发酵液中的物质变化及其抑菌机理进行了研究。 主要研究结果如下:1从红茶菌中分离了3类共12株微生物 从红茶菌中分离和鉴定的微生物有:6株醋酸菌包括2株液化醋杆菌(A.liquefaciens),1株醋化醋杆菌(A.aceti),2株重氮营养醋杆菌(A.diazot-rophicus),1株甲醇醋杆菌(A.metha nolica),4株酵母菌包括克鲁丝假丝酵母(Candida Krusei),汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii),栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces prombe Linder),酿酒酵母(Saccharomyces cerivisiae),乳酸菌LA(Lactobacillus A)及乳酸菌LP(Lactobacillus P)。其中重氮营养醋杆菌(A.diazot-rophicus)、甲醇醋杆菌(A.metha nolica)为首次发现。2培养过程中菌相处于动态变化中 在培养过程中发现,红茶菌发酵液每毫升的微生物数量比每克菌膜中多。培养至第6d,发酵液中的醋酸菌的数量比菌膜中的数量高出7倍;酵母菌的数量高2倍。在培养过程中醋酸菌和酵母菌的生长曲线相似。发酵液中的乳酸菌数量比酵母菌和醋酸菌低,其对数生长期在培养后的第6d~8d,比醋酸菌、酵母菌慢得多。培养时间长短不同,菌的数量存在差异。 从红茶菌中分离出的醋酸菌和酵母菌分别培养,发酵液中的数量变化具有典型的微生物生长曲线,但醋酸菌和酵母菌混合培养,二者的发酵液中的数量变化趋势无显著差异,但其发酵液中的微生物数量高于红茶菌菌膜培养的数量,pH值高于红茶菌发酵液。3红茶菌成膜及发酵液中的物质变化 红茶菌培养成膜与糖代谢密切相关。培养液糖含量是影响成膜的主要因素,添加适当浓度酒精、酵母膏和蛋白胨能明显提高菌膜的生成量;培养液的表面积增大,有利于膜的形成;仅以酒精作为碳源不成膜。培养液pH高低与膜生成量呈负相关。 红茶菌培养过程中,发酵液中的可溶性固形物含量变化基本呈直线下降趋势,pH值在发酵前期急剧下降,中后期保持稳定。培养12d,发酵液中游离氨基酸总量从培养液的70.494μg/mL降到27.439μg/mL。酵母菌Y3、醋酸菌C64和乳酸菌LA和LP混合培养,形成了培养液没有的氨基酸。 在酵母菌Y3、醋酸菌C64、乳酸菌LA、LP、红茶菌分别培养及Y3、C64、LA、LP混合培养中,其发酸液中儿茶素的总量下降。但在酵母菌Y3、醋酸菌C64分别培养中,发酵液中的EGC、EC含量大幅度增加,其他儿茶素含量都下降,而ECG降至培养液的20%以下。在乳酸菌LA、LP分别培养中,发酵液中的EGC、EC含量大幅度减少,DL-C、GCG含量大幅度增加。红茶菌及酵母菌Y3、醋酸菌C64和乳酸菌LA和LP混合培养中,而DL-C、EC含量增加。结果表明,酵母菌、醋酸菌具有降解酯型儿茶素的作用,乳酸菌有改变儿茶素空间结构的作用。4抗菌优势微生物的筛选 除去乙酸的醋酸菌发酵液,有促进指示菌生长的作用,选择出了促进作用较弱的C64菌株。酵母菌、乳酸菌均具有一定的抑制指示菌的能力,醋酸菌C64和Y3混合培养抑菌效果最强,选择出了具有较强抑菌能力的酵母菌Y3和乳酸菌LA和LP。因此,确定了抗菌能力强的优势微生物粟酒裂殖酵母Y3、醋酸菌C64、乳酸菌LA和乳酸菌LP组合。5发酵液蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳条件优化 对红茶菌发酵液蛋白质的分析方法进行了研究。结果表明,调节发酵液pH至6.0,加入0.2%不溶性PVP,振荡20min,4000r/min离心15min,MD34透析袋透析3d,冷冻浓缩获得的蛋白质电泳样品液;11%分离胶,5%浓缩胶电泳,能获得清晰的蛋白质谱带。6发酵液抗菌是酸性物质、抗菌蛋白、茶多酚等协同作用的结果 采用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌作为指示菌,分别对不同浓度的茶叶水浸出物,红茶菌发酵液的pH值,发酵液的透析液,透析液分别经胰蛋白酶、过氧化氢酶、蛋白酶K处理的样品液的抑菌效果进行了研究。1.0%(W/V)茶叶的水浸出物、红茶菌发酵液及发酵液的透析液对指示菌均有抑菌效果,经胰蛋白酶、蛋白酶K处理的样品液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑制效果明显降低,说明红茶菌发酵液中存在抑菌蛋白。红茶菌发酵液的抗菌作用是由酸性物质、抗菌蛋白、茶多酚协同作用的结果。……   
[关键词]:红茶菌;醋酸菌;酵母菌;乳酸菌;抗菌蛋白质;儿茶素
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:湖南农业大学2007年