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重组人白细胞介素-1受体拮抗剂的表达、复性、纯化及中试生产工艺研究

李树刚

   现代生物技术,几乎使人们可以获得任何需要的蛋白,用于蛋白质结构和功能研究。然而,要利用这一技术获得大量的能够满足产业化需要、质量符合临床要求的药用蛋白,却面临巨大的挑战。蛋白质的复性和纯化,作为生物工程下游技术的重要部分,往往是以大肠杆菌为表达系统,生产特定蛋白药物的瓶颈。白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)为白细胞介素-1(IL-1)家族的一员,能特异性地与IL-1受体结合,从而拮抗IL-1的各种生物学效应。在临床上广泛用于治疗IL-1参与病理变化过程的一些相关疾病。IL-1ra临床用量很大,每剂量高达100mg。但目前为止,国内还没有IL-1ra产业化生产的报道。因此本研究对重组IL-1ra中试生产工艺进行研究。首次成功地在中试规模下,将复性原理应用于IL-1ra包涵体复性,实现复性纯化同步完成,复性率达到70%,产物得率达到65%,比国内外最好产率提高3.7倍。这对于国内重组蛋白药物的产业化工艺研究具有重要的参考价值。 本文主要研究结果如下: 1.根据GenBank中人类IL-1ra基因序列(GenBank登录号: EF140714),兼顾稀有密码子和大肠杆菌密码子偏好性,改造编码序列,人工合成hIL-1ra成熟蛋白cDNA编码序列。构建原核表达载体pLY-hIL-1ra。通过对表达量和遗传稳定性的筛选,确定BL21为最适宿主菌,并成功构建工程菌株BL21/pLY-hIL-1ra。 2.在揺瓶条件下对工程菌株BL21/pLY-hIL-1ra发酵条件进行初步摸索,确定最佳诱导时机为生长中期,诱导温度42℃,诱导时间为4h。在此基础上,进一步用3.7L发酵罐,对实验室条件下发酵工艺条件进行优化。确定的工艺条件为:①用半合成培养基,以甘油作为碳源,采用溶氧反馈分批补料培养方法进行发酵;②25%浓氨水调节pH维持在7.0左右,30℃培养5小时后,开始以脉冲方式流加补料液,通过调节转速、进气量、罐压、补料速度控制溶氧大于30%;③接种10小时后,升温到42℃,诱导4小时,菌体湿重达到58 g/L,表达量38%。将此工艺放大到30L发酵罐,菌体湿重可达60 g/L,重组蛋白质的表达量为34%。表明该工艺条件适合工程菌株的高密度发酵,达到了中试规模要求。 3.在实验室规模下,对重组IL-1ra包涵体释放、洗涤和溶解条件进行初步研究。以获得的参数作为参考,放大到中试规模。确定中试规模条件为: ①菌体破碎。高压匀浆破碎菌体,菌体(g):缓冲液(ml)=1:10,压力40M Pa,循环4次;破菌率可达96%,一次处理湿菌体量1 000g,可获得粗包涵体约250g;缓冲液组成:20 mmol/L Tris-HCl,5 mmol/L EDTA,pH 8.0。 ②包涵体洗涤。洗涤分4步进行,洗涤缓冲液(ml):粗包涵体(g)=10:1,在搅拌罐内混悬,转速控制在200 rpm,每个洗涤步骤洗涤30min,目标蛋白的纯度可达72%。洗涤缓冲液组成:第一次为20 mM Tris-HCl,5mM EDTA, pH8.0;第二次为20 mM Tris-HCl,5mM EDTA,100 mM NaCl,1%TritonX-100,1M尿素,pH8.0;第三次为20 mM Tris-HCl,5mM EDTA,1%TritonX-100,100 mM NaCl,pH8.0;第四次为20 mM Tris-HCl,5 mM EDTA,pH8.0。 ③包涵体溶解。溶解缓冲液(ml):包涵体(g)=20:1,溶解时间6h,温度为室温,同时进行搅拌,转速为200 rpm。溶解缓冲液组成:20 mM Tris-HCl,5 mM EDTA,5 mM DTT,6M尿素,pH8.0。 4.在实验室规模条件下,对IL-1ra包涵体色谱复性及纯化条件进行研究,实现复性和纯化同步完成。条件为:选择Q-Sepharose Fast Flow阴离子色谱;复性温度10℃,pH8.0;尿素浓度梯度为6mol/L降到2.1mol/L时,复性缓冲液用量4倍柱体积;线性流速为0.565cm/min;负载量为200ml,含目标蛋白约1 024mg;pH6.5条件下梯度洗脱,流速控制在6.0 ml/min,NaCl浓度由0到0.4M的时间控制在50min。在此条件下,蛋白收率约70%,样品生物比活性达到10万单位/mg,与Sigma公司销售的对照品一致,纯度达98%以上。以实验室条件作为参照,将此工艺成功放大到中试规模。选择BPGTMΦ70mm×L 500mm色谱柱,流速控制在0.754 cm/min,在复性温度、pH等与实验室规模一致的条件下,负载量增加到2 000ml包涵体溶液,含目标蛋白约10240mg,目的蛋白回收率65%,纯度98%,生物比活性达到10万单位/mg,与对照品一致,每升发酵液纯品产率为890mg。表明此工艺到达中试规模要求。 5.内毒素去除。选用SP-Spharose Fast Flow强阳离子交换色谱,让内毒素直接穿出色谱介质,而样品仍保留在色谱介质上。通过进一步改变pH,让目标蛋白解吸下来,达到去除内毒素的目的,同时去除复性纯化样品中残留的尿素。在实验室条件基础上,将此工艺成功放大到中试规模,单次处理量达到6.7g目的蛋白,内毒素由200EU/mg-260EU/mg降低到小于0.5EU/mg,满足了安全用药的要求,回收率为93%。 6.初步建立了原液的稳定性条件。20℃条件下,通过研究pH和保护剂浓度等因素对目的蛋白稳定性的影响,确定了保存目的蛋白活性的适宜条件为:pH6.5,蔗糖浓度为1.8%。 7.对原液的质量进行了鉴定和检测。①理化鉴定:用MADLI-TOF MS法,进行分子量的测定,复性纯化后的rhIL-1ra分子量为17.224kD,与理论分子量一致;肽图分析和West-Blotting免疫特异性分析及N端15个氨基酸残基序列分析结果显示,复性纯化后的rhIL-1ra与对照品一致,基本证实复性纯化后的rhIL-1ra理化特性与理论一致。②纯度、活性检测:用RP-HPLC检测纯度,rhIL-1ra原液纯度大于98%,满足临床用药纯度要求;用小鼠胸腺细胞-MTT法测定活性,rhIL-1ra原液比活力10万U/mg,与对照品一致。③对部分安全性指标的检测结果显示,安全性指标满足2005版中国药典相关要求。……   
[关键词]:rhIL-1ra;包涵体;复性;离子交换层析;中试放大;内毒素;稳定性;质量鉴定
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:重庆大学2007年