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瓜类疫病菌的鉴定以及Phytophthora melonis和P. sojae的分子检测

王颖

   本文就瓜类疫病菌的鉴定以及P. melonis、P. sojae的分子检测进行了研究,采用PCR技术克隆了P. melonis的核糖体和线粒体基因,并与近似种进行了序列比对;同时采用普通PCR、套式PCR和实时定量PCR等技术对P. melonis、P. sojae的游动孢子、卵孢子、发病植株、病田的土壤和灌溉水样品进行了定性和定量检测。 本研究对3个Phytophthora melonis菌株及近似种P. drechsleri、P. sinensis的形态学、生物学特征进行了比较,同时对3个P. melonis菌株的ITS(internal transcribed spacer)、β-tubulin、EF-1α(translation elongation factor 1a)、cox1(cytochrome c oxidase subunit 1)和nadh1(NADH dehydrogenase subunit 1)基因进行了克隆、序列测定,并将上述序列与Genbank中已登录的P. melonis、P. sinensis、P. sojae、P. vignae、P.drechsleri和P. cryptogea等6个形态学种14个菌株的相应基因序列进行比较,在对各菌株之间的遗传距离进行分析的基础上构建了不同种之间的聚类分析树状图。结果表明,P. melonis和P. sinensis是同一个种,与P. sojae、P. vignae的亲缘进化关系比较近,而与形态学近似种P. drechsleri的亲缘关系比较远,是2个不同的种,建议将P. sinensis和近似的菌株划分到重新定义的P. melonis中。 Phytophthora melonis引起的疫病是黄瓜等作物生产上的主要病害,本文比较了卵菌核糖体基因ITS的序列,并以该序列为靶标设计了1对针对P. melonis的特异性PCR引物Pm1和Pm2,在此基础上开发了该病的快速诊断技术。供试的55种不同真菌和疫霉菌的115个菌株中,利用这对引物只能从P. melonis基因组DNA中扩增出一条分子量为545 bp的特异性条带,该引物的检测灵敏度可达100fg。以卵菌ITS区通用引物DC6/ITS4和Pm1/Pm2进行套式PCR扩增,可以使检测灵敏度至少提高1000倍,能够检测到100 ag的基因组DNA。Pm1/Pm2对灭菌水中游动孢子的检测精度可达0.5个游动孢子,通过套式PCR对0.5 g灭菌土中游动孢子的检测的灵敏度可达10个游动孢子。本研究以PCR为基础建立了一套分子检测方法,可对田间土壤、灌溉水和发病植物组织中的P. melonis进行快速灵敏的检测,同时利用SYBR GreenⅠ染料对发病植株进行了实时定量PCR检测,这套方法可用于该病害的快速分子诊断,有助于病害综合治理水平的提高。 大豆疫霉(Phytophthora sojae Kaufmann & Gerdemann)侵染大豆引起的疫霉根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一,也是我国的一类对外检疫对象。目前大豆疫病的分子检测是以ITS为靶标序列设计的,存在无法与近缘种区分的问题。本研究根据GenBank中登录的Phytophthora35个种的Ypt1基因序列差异设计1对引物PsYpt3F/PsYpt2R,可以特异地从52个Phytophthora sojae菌株中扩增到一条220 bp左右的条带,而从112个其它疫霉、腐霉和真菌供试菌株中不能扩增出条带,表明该对引物可以将大豆疫霉与其它卵菌和真菌区分开,特别是可以区分以ITS序列作为靶标无法区分的近缘种P. melonis。以疫霉菌Ypt1基因通用引物Yph1F/Yph2R和PsYpt3F/PsYpt2R进行套式PCR扩增,可以检测到10 pg的基因组DNA、1个卵孢子和1个游动孢子。同时利用快速的NaOH裂解法,引物PsYpt3F/PsYpt2R也可用于接种发病大豆植株的检测。本研究还将特异引物PsYpt3F/PsYpt2R与荧光染料SYBR~(?)GreenⅠ结合,成功建立了大豆疫霉菌的实时PCR检测方法,由于Ypt1基因是单拷贝存在,在进行定量检测量时比用ITS序列作为靶标更准确。本文中建立的普通PCR和实时PCR反应体系可望应用于口岸和田间对大豆疫霉菌的检测。……   
[关键词]:Phytophthora melonis;P. sinensis;P. drechsleri;P.sojae亲缘关系;分子检测
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京农业大学2007年