手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

嗜水气单胞菌J-1株β溶血素基因缺失株的构建及特性分析

熊华萱

   嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)是重要的人畜共患病病原菌,可引起多种动物全身性败血症或局部感染。Red重组系统具有抑制宿主外切核酸酶阻止外源线性DNA片段降解的能力,能够启动高效的双链断裂修复和瞬间重组,重组效率高,逐渐成为基因功能探索以及新菌株构建的有力手段。 β溶血素是嗜水气单胞菌主要的毒力基因之一。根据已发表的嗜水气单胞菌β溶血素基因的核甘酸序列,设计合成一对引物,以Ah J-1基因组DNA为摸板,通过PCR扩增得到β溶血素全基因序列,将该基因片段连接到pMD18-T载体中,构建克隆载体并测序。测序结果显示Ah J-1株β溶血素基因全长1588 bp,含有1482 bp的开放阅读框,编码493个氨基酸。将所获的Ah J-1株的β溶血素基因序列登录GenBank,序列号为DQ408263。序列分析发现与已发表的TPS30等多株嗜水气单胞菌的β溶血素基因100%同源,表明该基因较为保守。 根据Ah J-1株β溶血素的基因序列设计一对引物,引物5’端有40 bp的拟敲除基因的同源臂,3’端20bp为扩增引物,以pKD4为模板,扩增两侧含FRT位点的卡那霉素抗性基因将氯霉素抗性的质粒pKD46电转化入目标菌Ah J-1,携带质粒pKD46的菌株Ah J-1,在阿拉伯糖诱导后,表达λ噬菌体的3个重组蛋白,宿主菌就具有了同源重组的能力。将此线性片段电转入具重组功能的感受态细胞,利用卡那霉素平板就可以筛选到阳性转化体。利用该重组系统,构建了β溶血素缺失的Ah J-1菌株,并检测了该缺失株对小鼠的毒力和生化特性,缺失株的LD_(50)为2.3×10~9,只有一个生化特性发生改变。 用Ah J-1β溶血素缺失株免疫健康小鼠,以未免疫小鼠为对照,用半定量RT-PCR的方法检测其细胞因子IL-4、IL-6、IFN-γ的含量及mRNA的表达水平,扩增产物经电泳分离后,用凝胶图像分析仪照相和扫描分析其相对表达量。结果显示RT-PCR产物经电泳后,分别检出IL-4、IL-6、IFN-γ、β-actin在180 bp、600bp、243 bp和348 bp处出现明显条带,表达量显著高于对照组,以5LD_(50) Ah J-1亲本株攻击,免疫保护力达到80%,PCR产物量与扩增初始模板量之间存在良好的对应关系。Th1和Th2共同作用参与免疫保护。……   
[关键词]:嗜水气单胞菌;β溶血素基因;RED重组系统;基因敲除;免疫
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京农业大学2007年